表不雅观遗传润色是通过化学润色改变染色体上的DNA和蛋白质，这种润色可以影响基因的转录、剪接、翻译、核小体组装和染色质构造等多个层面，从而影响植物的成长发育以及生物或非生物胁迫相应过程。表不雅观遗传润色紧张包括DNA润色、组蛋白润色和染色质重塑等。伯小远在往期推文“生命科学研究热点——组蛋白润色”、“蛋白翻译后润色研究套路”中先容了组蛋白润色以及组蛋白润色的研究方法。在这篇文章中，伯小远将给大家先容DNA润色的干系内容，DNA润色紧张是指DNA甲基化（DNA methylation），DNA甲基化与植物的基因表达、成长发育和抵御困境胁迫等主要的生命过程有着密切的联系。研究DNA甲基化是当今表不雅观遗传学的热点之一。全基因组重亚硫酸盐测序（Whole genome bisulfite sequencing, WGBS/BS-seq）是DNA甲基化研究的金标准。本日就随着伯小远一起学习一下DNA甲基化以及BS-seq技能是如何利用到植物DNA甲基化研究的吧。
1 DNA甲基化的定义
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine, SAM）为甲基供体，将甲基基团共价结合到DNA分子上的一种润色形式(Lister et al., 2008)。DNA甲基化润色可以发生在多个位点，包括胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位及鸟嘌呤的G-7位。一样平常我们所关注的DNA甲基化紧张是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化，其产物称为5-甲基胞嘧啶（5-mC）。这是动植物等真核生物中DNA甲基化的紧张形式。
2 植物DNA甲基化的模式
在植物中，DNA甲基化是从头甲基化（De novo methylation）、坚持甲基化（Methylation maintainance）和去甲基化（Demethylation）三者动态调节的结果，并且这些调节路子受到不同酶的催化（图1）。
图1 DNA甲基化在植物中的动态调节及干系酶(Arora et al., 2022)
2.1从头甲基化
在植物中，从头甲基化是通过RNA介导的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation, RdDM）路子介导完成的甲基化润色过程(Matzke et al., 2014)。RdDM路子的过程紧张概括为以下3个步骤：
（1）依赖RNA聚合酶Pol IV的小滋扰RNA（Small interfering RNAs, siRNAs）的产生；
（2）依赖RNA聚合酶Pol V的长非编码RNA（Long intergenic noncoding RNAs, lincRNAs）的产生；
（3）siRNAs和AGO蛋白结合并与lincRNAs互补配对，招募甲基转移酶2（Domain rearranged methyltransferase 2, DRM2）至靶标位点建立DNA甲基化。
图2 植物RdDM模型(Matzke et al., 2014)。在Pol IV的参与下，通过富集转座子和重复元件干系区域，转录产生单链RNA（ssRNA），之后由RNA依赖的RNA聚合酶2（RNA-dependent RNA polymerase 2, RDR2）以单链RNA为模板复制合成双链RNA（dsRNA），再通过Dicer-like 3（DCL3）蛋白将双链RNA切割发展度为24nt的siRNA。成熟的siRNA与AGO4蛋白结合形成复合体，并与Pol V转录的scaffold RNAs配对召募DRM2，终极完成从头甲基化润色过程。
2.2坚持甲基化
坚持甲基化是指复制后的半甲基化序列转变为全甲基化序列的过程，植物DNA甲基化的坚持取决于胞嘧啶的甲基化类型。根据DNA甲基化发生的序列差异，可以将植物DNA甲基化润色分为三种：CG、CHG和CHH（H表示A、T或C），CG和CHG属于对称甲基化润色，而CHH属于非对称甲基化润色(Law and Jacobsen, 2010)。个中，CG甲基化是拟南芥中最常见的甲基化形式(Cokus et al., 2008)。
不同类型的甲基化形式由不同的甲基转移酶催化（图1）。CG甲基化由DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1, MET1）坚持。MET1是哺乳动物DNA胞嘧啶5-甲基转移酶1（DNA cytosine-5-methyltransferase 1, DNMT1）的嫡系同源物，它通过识别DNA复制后半甲基化的CG二核苷酸，并将子链中未润色的胞嘧啶甲基化。CHG甲基化由染色质甲基化酶2（Chromomethylase 2, CMT2）或者染色质甲基化酶3（Chromomethylase 3, CMT3）坚持。CHH甲基化由构造域重排甲基转移酶2（Domains rearranged methyltransferase 2, DRM2）或CMT2坚持。
2.3去甲基化
去甲基化是指在去甲基化酶的浸染下DNA序列上的甲基基团被切除的过程，常日发生在5-mC上。去甲基化可以分为被动去甲基化和主动去甲基化。被动去甲基化是指在DNA复制过程中，新合成的DNA链没有被DNA甲基转移酶精确靶向和甲基化，导致DNA甲基化水平降落。主动去甲基化是指在去甲基化酶的浸染下，5-mC被正常胞嘧啶更换的过程。
图3 DNA去甲基化机制(Liu et al., 2020)。被动DNA去甲基化可在DNA复制过程中发生，新合成DNA中的DNA甲基化水平会被降落。主动DNA去甲基化是由植物特有的ROS1/DME酶家族介导的，ROS1和DME分别通过MBD7-IDM或SWR1复合体以及促进染色质交易（FACT）复合体被招募到目标位点。甲基化的胞嘧啶经ROS1或DME识别后，从氮真个糖苷键处断裂形成了无碱基位点，然后被一个未甲基化的胞嘧啶修复，从而完成了这个位点的去甲基化润色过程。
3 DNA甲基化的功能
DNA甲基化在调节植物基因表达、坚持植物基因组的稳定性以及调控植物成长发育、相应外界困境胁迫等方面发挥了主要浸染。这里伯小远就大略列举一些文献来看看DNA甲基化在植物成长发育以及胁迫相应上面的功能吧，但是关于DNA甲基化的功能研究远不止如此，大家感兴趣的话可以自行查阅文献资料噢。
3.1参与植物成长发育
DNA甲基化参与调控肉质果实的成熟。番茄去甲基化酶基因SlDML2的敲除使得全基因组范围内的甲基化水平升高，勾引果实成熟的基因表达受到抑制，导致番茄果实不能正常成熟(Liu et al., 2015)。草莓果实成熟过程中DNA甲基化水平会整体下调(Cheng et al., 2018)。然而甜橙果实发育和成熟期间全基因组DNA甲基化水平会增加(Huang et al., 2019)。
DNA甲基化参与调控植物花色。海棠花青素生物合成干系基因MhMYB10的启动子区域高度甲基化，使MhMYB10基因表达减少，终极导致花青素积累减少(Han et al., 2020)。牡丹PrANS和PrF3H启动子的DNA甲基化使其在花瓣非色斑区域的表达量降落，进而影响了牡丹花瓣颜色(Zhu et al., 2023)。
3.2参与植物胁迫相应
水稻缺铁会在基因附近产生大量以CHH类型为主的超甲基化区域，并且铁旗子暗记通路核心转录因子OsbHLH156和IRO2在缺铁条件下发生了显著的差异甲基化(Sun et al., 2021)。在盐胁迫下，SlSAMS1过表达能够提高SlGI基因体的甲基化水平，进而增强SlGI的表达以提高番茄植株的耐盐性(Chen et al., 2023)。
4 检测DNA甲基化的方法——BS-seq
目前，BS-seq、简约亚硫酸氢盐测序（RRBS）、甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）测序和甲基化敏感扩增多态性技能（MSAP）都可以用于植物全基因组范围内DNA甲基化的检测。本日伯小远紧张给大家先容DNA甲基化研究的金标准——BS-seq。
4.1BS-seq技能事理
BS-seq通过亚硫酸氢盐（Bisulfite）处理DNA序列，将基因组中未发生甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶包括5mC和5hmC则保持不变。这样可以将甲基化的C与未甲基化的C区分开来。接着进行PCR扩增，结合高通量测序技能，从而绘制出全基因组范围内单碱基分辨率的DNA甲基化图谱。
图4 BS-seq技能事理(袁明波等，2024)。
4.2BS-seq运用
BS-seq可以全面剖析DNA甲基化水平及其变革。它可以检测不同样本之间的DNA甲基化差异：包括不同发育阶段的DNA甲基化差异，这对理解发育过程中的表不雅观遗传调控机制至关主要；外部环境成分可以影响DNA甲基化，BS-seq可以帮助我们理解环境成分如何通过甲基化改变基因表达，从而影响植物的成长发育。此外，BS-seq还可以比较突变体与野生型之间的DNA甲基化差异，帮助揭示基因突变对甲基化模式和基因表达调控的影响。接下来我们利用三篇文献来理解BS-seq在植物研究中的运用吧。
案例1——不同发育阶段的DNA甲基化
2024年2月，青岛农业大学张玉刚课题组在Horticulture Research杂志上揭橥了一篇题为“Hypermethylation in the promoter regions of flavonoid pathway genes is associated with skin color fading during ‘Daihong’ apple fruit development”的研究论文。作者以R1R6型红肉苹果品种“黛红”（DH）为材料，结合遗传背景剖析、代谢组、转录组、甲基化组及分子生物学手段解析了DNA甲基化参与苹果果皮褪色的机理。
作者不雅观察了七个发育阶段DH果实表型性状和果皮花青素含量，创造其幼果期果皮光荣为深赤色，花青素含量丰富，随着果实发育果皮光荣变浅，成熟期的DH苹果果皮以绿色为主（图5）。
图5 七个发育阶段的DH果实表型性状和果皮花青素含量(Xu et al., 2024)。（a）S1-S7阶段的果皮颜色。S1-S7表示着花后30d、45d、55d、71d、90d、110d和131d的果实；（b）从DH果皮中提取的花青素；（c）单果重量；（d）通过pH示差法测定DH果皮花青素含量。
为了研究DH果实发育过程中的DNA甲基化图谱，作者对S1、S4和S7三个发育阶段的果实果皮进行了BS-seq剖析，创造随着果实的发育，CG和CHG类型的相对甲基化水平低落，而CHH类型的相对甲基化水平上升（图6a）。总体而言，全基因组范围内甲基化水平随着果实发育而增加（图6b）。此外，在CG、CHG和CHH三种甲基化类型中，基因体和转座子元件（TE）上游或下贱2k区域的DNA甲基化水平从S1到S7均逐渐增加（图6c、d）。
图6 DH果皮的DNA甲基化剖析(Xu et al., 2024)。（a）mC、mCG、mCHG和mCHH在发育阶段S1、S4和S7的相比拟例；（b）CG、CHG和CHH在S1、S4和S7处的DNA甲基化水平；（c）在S1、S4和S7区域，基因上游和下贱2k区域的DNA甲基化水平；（d）在S1、S4和S7区域，TE上游和下贱2k区域的DNA甲基化水平。
由于启动子区域的DNA甲基化会影响基因的表达，因此作者将花青素生物合成和降解过程中关键基因的甲基化水平和转录水平进行了关联剖析，创造构造基因MdCHS、MdCHI、MdF3H、MdANS、MdUFGT、MdLAR和MdANR在其启动子区域内的DNA甲基化水平从S1到S7阶段呈上升趋势，而其转录水平呈低落趋势（图7）。调控基因MdbHLH3、MdMYB10、MdMYB16、MdMYB28和MdMYB111启动子区域内的DNA甲基化水平和转录水平均从S1到S7呈上升趋势（图7）。
图7 参与花青素积累的基因启动子DNA甲基化水平和表达水平(Xu et al., 2024)。蓝线表示转录水平（FPKM），黑线表示甲基化水平（%）。
案例2——胁迫处理下的DNA甲基化
2022年10月，云南大学乔琴课题组与云南中医药大学张体操课题组联合在BMC plant biology杂志上揭橥了一篇题为“Integrated transcriptome and methylome analyses reveal the molecular regulation of drought stress in wild strawberry (Fragaria nilgerrensis)”的研究论文，作者通过对干旱胁迫处理四个不同韶光点的草莓的生理性状、基因表达谱、全基因组DNA甲基化图谱剖析，综合解析了草莓的干旱相应调控网络。
作者不雅观察了干旱胁迫不同韶光点的草莓形态，并测定了脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的含量和相对电导率（REC），创造在T8韶光点草莓形态以及生理指标的变革较大（图8）。
图8 干旱胁迫下草莓的生理性状剖析(Cao et al., 2022)。（A）草莓在干旱胁迫下的形态变革；（B）在干旱处理的四个韶光点检测Pro、MDA、SOD、POD和REC。\
为了研究干旱胁迫下DNA甲基化的调控机制，作者进行了BS-seq剖析，创造CG、CHG和CHH三种类型的DNA甲基化水平分别为47.69%、30.87%和10.56%（图9A）。mCG、mCHG和mCHH在总DNA甲基化位点中的百分比在不同干旱胁迫韶光点表现出动态变革，个中mCHH不仅占比最高，而且表现出最大变革（图9B）。在干旱胁迫期间，草莓基因启动子和重复序列的DNA甲基化水平显示出CHH甲基化的显著变革（图9C）。由于启动子和基因体的甲基化对基因表达有不同的影响，将差异甲基化基因（DMG）分为启动子DMG和基因体DMG，结果表明在干旱胁迫的所有韶光点草莓启动子DMG均高于基因体DMG（图9D）。在启动子DMG中，所有韶光点有317个低甲基化（hypo）共有基因和21个高甲基化（hyper）共有基因（图9E），表明这些基因的甲基化水平动态变革，可能直接或间接参与调控表达基因对干旱胁迫的调控。
图9 干旱胁迫下四个韶光点DNA甲基化水平变革(Cao et al., 2022)。（A）T8韶光点CG、CHG和CHH类型的DNA甲基化水平变革；（B）干旱胁迫不同韶光点CG、CHG和CHH类型的DNA甲基化相比拟例；（C）DNA甲基化的动态变革，包括基因组分和重复序列；（D）不同干旱胁迫韶光点的DMR及DMG数量；（E）启动子DMG的Upset-Venn图。
案例3——突变体与野生型材料的DNA甲基化
2023年1月，华中农业大学康春颖课题组在Plant Physiology杂志上揭橥了一篇题为“Factor of DNA methylation 1 affects woodland strawberry plant stature and organ size via DNA methylation”的研究论文，作者通过BS-seq和转录组剖析揭示了林地草莓（Fragaria vesca）DNA甲基化因子1（FDM1）通过调控DNA甲基化，从而影响林地草莓叶片、花朵和果实大小，表明了RdDM在草莓成长发育过程中的关键调控浸染。
作者利用CRISPR/Cas9技能敲除FveFDM1得到三个敲除株系fvefdm1（L1-L3），创造与WT比较，fvefdm1发育出较小的叶片（图10A-E），fvefdm1的近轴叶表皮细胞数量显著减少，细胞大小增加（图10F、G），fvefdm1幼叶中FveFDM1的表达水平显著降落（图10H）。
图10 利用CRISPR/Cas9技能得到fvefdm1突变体及表型不雅观察(Zheng et al., 2023)。（A）FveFDM1中sgRNA靶位点示意图；（B）T0代中的三个fvefdm1突变体（L1-L3）和WT的植株表型；（C）T0代中的三个fvefdm1突变体（L1-L3）的突变情形；（D）fvefdm1（L1-L3）和WT成熟叶片；（E）fvefdm1（L1-L3）和WT叶片大小；（F）fvefdm1（L1-L3）和WT叶片表皮近轴侧的细胞；（G）fvefdm1（L1-L3）和WT叶片表皮近轴侧的细胞数量和细胞大小；（H）FveFDM1在fvefdm1（L1-L3）和WT幼叶中的表达水平。
为了研究FveFDM1的分子功能，作者利用BS-seq检测了WT和fvefdm1中DNA甲基化水平，创造与WT比较，fvefdm1所有基因体和TE中CG和CHG类型的均匀甲基化水平基本保持不变，CHH类型的均匀甲基化水平显著减少（图11A）。接着作者在fvefdm1和WT之间鉴定了差异甲基化区域（DMRs），共识别出16831个CG DMR、46264个CHG DMR和74749个CHH DMR，个中大多数为hypo DMR（图11B），并且在fvefdm1中hypo DMR的DNA甲基化水平显著降落（图11C）。三种甲基化类型的hypo DMR紧张富集于仅基因体区域或同时覆盖基因体和TE区域（图11D）。更详细地说，三种情形下的hypo DMR在基因的启动子中相对更丰富（图11E）。结果表明，FveFDM1在最有可能影响基因表达的位置调节DNA甲基化。
图11 fvefdm1中的DNA甲基化水平和siRNA丰度(Zheng et al., 2023)。（A）WT和fvefdm1中所有基因和TE中CG、CHG和CHH甲基化的均匀水平，包括转录起始位点（TSS）上游2kb和转录终止位点（TTS）下贱2kb；（B）fvefdm1中CG、CHG和CHH中相对付WT的hyper-DMR和hypo-DMR数量；（C）WT和fvefdm1中hypo-DMR中的CG、CHG和CHH甲基化水平方框图；（D）CG、CHG和CHH中hypo-DMR的基因组分布；（E）CHH hypo-DMR在不同基因组区域分布。Promoter表示TSS上游2kb，Downstream表示TTS的下贱2kb；（F）WT和fvefdm1中与基因组比对的siRNA的大小分布；（G）下调（downregulated）（n=23395）或随机（random）（n=23395）siRNA簇与CHH-hypo-DMR重叠或不重叠的百分比。
此外，作者还创造FveFDM1和FveIDN2蛋白的表达可由GA勾引，FveFDM2和FveIDN2的蛋白复合物直接结合AGO4 siRNA，以影响靶位点的DNA甲基化水平，下贱调控基因受到DNA甲基化的促进或抑制，通过滋扰细胞分裂终极导致器官大小改变。
图12 草莓中FveFDM1基因的功能模型(Zheng et al., 2023)。
小远叨叨
在本篇文章中，伯小远首先给大家先容了植物DNA甲基化的模式，大家可以理解到DNA甲基化是从头甲基化、坚持甲基化和去甲基化三者动态调节的结果；然后简要先容了DNA甲基化在植物成长发育以及困境胁迫相应过程中的功能；末了先容了检测DNA甲基化的“金标准”——BS-seq，以及BS-seq技能的运用处景。希望通过以上内容给大家的研究带来一点点思路。
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