文丨vb动脉网，作者丨曹弦
提及2019年基因测序领域的发展，“单细胞测序”毫无疑问是个中关键词。
2019年9月，美国单细胞测序公司10x Genomics在纳斯达克上市，IPO3.9亿美元，成为该领域的领头羊。海内单细胞测序行业发展较为滞后，但也颇受成本青睐。2019年3月，万乘基因完成五百万元天使轮融资；6月，百奥智汇完成A轮融资，新格元生物完成近亿元pre-A轮融资；10月，寻因生物完成数千万元pre-A轮融资。
单细胞测序即从单个细胞水平上对基因组进行测序，把基因测序运用到单个细胞层面，从而识别细胞的类型、功能，特定细胞康健或状态的变革、变异。而常规的基于NGS的基因检测，都是在大量细胞宏不雅观水平上，对全体细胞群进行遗传剖析。
近年来，单细胞测序干系研究进步神速，截止到2019年，Pubmed中已揭橥1338篇科学文献。该技能已广泛运用于科研行业神经生物学、种系传播、器官成长、癌症生物学等多个领域的研究。
数据来源：Pubmed、动脉网整理
单细胞测序是单细胞遗传物质剖析的主要手段，并不是单细胞研究的全部。放眼环球，单细胞研究已经发展成多组学研究，包括单细胞转录组、基因组、表不雅观组、甲基化、ChlP、蛋白组等，总的来说紧张聚焦在两个领域：单细胞遗传物质剖析与单细胞蛋白剖析。
环球单细胞测序从2009年开始起步，彼时，北京大学汤富酬教授在博士后期间揭橥了天下第一篇单细胞mRNA测序的文章，引起业界广泛关注。2012年，美国单细胞高通量测序公司10x Genomics、Mission Bio相继成立。海内单细胞测序技能的运用从2014年起步，但大都集中在低通量领域，运用局限于运用为胚胎植入前遗传学检测（PGD），外周循环肿瘤细胞（CTC）等。
单细胞测序（SCS）发展进程：
（图片来源：Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies、动脉网绘制）
在高通量测序领域，以试剂盒、微流控设备研发为核心的企业如寻因生物（2015年）、微著生物（2017年）、新格元生物（2018年）、万乘基因（2018年）等通过自主研发核心技能微流控，将单细胞测序从实验室走到市场，并完成早期融资；以单细胞生信剖析为主的代表企业百奥智汇（2018年）也完成了IDG成本的A轮融资。
在基因层面，单细胞测序可以获取更精准的遗传信息，在蛋白层面，通过剖析单细胞表达的蛋白可以直接的获取人体免疫干系的靶点，用于免疫诊断、新药研发等。鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学剖析灵敏度的限定，单细胞蛋白剖析的常见、有效技能是质谱剖析，紧张技能包括质谱流式细胞术（Mass Cytometry）、TOF-SIMS（翱翔韶光二次离子质谱仪）剖析等。
质谱流式技能平台最初由美国DVS Science开拓，但这家企业于2014年被美国Fluidigm以2.1亿美元收购。海内单细胞蛋白剖析的代表企业为宸安生物、普罗亭，个中，宸安生物专注单细胞质谱流式诊断设备、试剂和软件开拓，普罗亭致力于以单细胞蛋白层面研究为核心的检测做事。
无论是基因层面，还是蛋白层面，单细胞剖析技能已然成熟，但囿于本钱并未广泛运用于市场上，更多的是为科研供应做事。动脉网整理了环球单细胞行业的目前发展状况，以及单细胞技能在赢来大规模运用之前面临的寻衅与机遇。
核心技能：单细胞测序与质谱流式细胞术
单细胞测序紧张有四个事情流程：单细胞制备、单细胞分离和文库制备、测序和低级剖析、生信剖析。单细胞制备常日采取机器法、酶解法或其他组合方案将组织裂解，随后将特定的细胞群富集、标记，成为单细胞样本。单细胞分离与文库制备是单细胞测序的关键步骤，与终极单细胞数据的质量、精准度息息相关。
低通量单细胞分离方法有梯度稀释、口吸移液、自动显微操作、激光捕获显微切割等，但由于一次只能处理一个细胞，日处理量为10个，效率低，本钱高，运用有限，本文不多作赘述。
高通量单细胞分离的方法紧张为三种，微孔（microwell-）、微液（microfluidic）以及微滴(droplet)，这三种方法都基于微流控事理。
基于微孔的捕获技能可以利用细胞移液器或激光捕获分离细胞，并将他们放置于微液流孔中。相较于另两种方法，细胞通量低，且仅能用于转录组测序，不能运用于其他组学。代表企业包括BD Biosicence、Cell Mircrosystem、Cellsee等。
微液技能是在微米级构造中操纵眇小液体的科学技能，将单细胞的培养、制备、反应、分离、检测等步骤集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成剖析全过程。相较于微孔，微液技能细胞通量更高，但缺陷是，只有10% 的细胞能够被捕获到，代表企业包括Fluidigm。微流控芯片是微流控技能的核心壁垒，基于传统单相的微流控芯片，逐步发展成为微液滴芯片，以微液滴芯片为核心的微流控技能成为微滴，微滴已得到广泛关注和运用，代表企业包括10x Genomics、万乘基因、1Cellbio、Mission Bio、dolomite bio等。
单细胞样品经捕获分离得到活性单细胞，随后将活性单细胞遗传信息扩增，建立测序文库，末了利用Illumina测序系统对单细胞文库进行测序，并进行遗传物质的生信剖析。
目前，海内单细胞测序企业大部分集中在高通量单细胞转录组测序设备、试剂、微流控芯片的开拓，并积极探索高通量单细胞多组学测序干系技能。
（从上至下依次为Cell Mircosystem基于微孔的产品CellRaft、Fluidigm基于微液的捕获技能C1、10x Genomics微滴系统Chromium）
单细胞蛋白剖析采取的质谱流式细胞术(Mass Cytometry)是一种将流式细胞技能与质谱剖析技能结合在一起的新技能。
大略来说，便是利用质谱事理、独特的金属标记抗体标记细胞表面和内部蛋白，对单细胞进行多参数检测的流式技能。
它继续了传统流式细胞仪的高速剖析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力，能在单细胞水平同时剖析超过50种细胞参数，相较于流式细胞技能常规剖析4-10种蛋白，在剖析效率上有极大的提升，是流式细胞术一个新的发展方向。
质谱流式采取金属元素标记物（常日是金属元素标记的特异抗体）标记或识别细胞表面和内部的旗子暗记分子，然后再用感应耦合等离子质谱（ICP-MS）不雅观察单个细胞的原子质量谱，末了将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的旗子暗记分子数据，并通过专业剖析软件对得到的数据进行剖析，从而实现对细胞生物标志物和旗子暗记网络的不雅观察与剖析。代表企业为Fluidigm和宸安生物。
单细胞测序与蛋白研究中虽然利用不同的核心技能，但实质都是从单细胞水平去探索、发掘基因、蛋白在机体的浸染机制，两者各有所侧重，各有上风。单细胞测序核心技能的微流控检测工具为核酸，借助于其高通量地检测能力，在单细胞转录组、基因组、表不雅观组等多组学研究中起着非常关键的浸染。
现有技能的条件可以实现同时对1万个细胞进行剖析，虽然市情上有许多的基因数据剖析软件，但全体建库、测序和数据剖析仍旧耗时长，单次测序韶光至少为两周，测序本钱高。
单细胞蛋白剖析的核心技能是质谱流式细胞术，检测工具为胞内或者细胞表面蛋白，因此在包括血液系统疾病、肿瘤免疫治疗和免疫系统疾病在内的繁芜疾病的诊断领域更具上风，质谱流式细胞术可实现对多达100万的细胞进行50种不同生物标志物剖析检测，由于质谱剖析壁垒高，针对单细胞的质谱剖析软件较少，常日须要企业自行研发，但总体单细胞蛋白剖析耗时较短，为1-2小时。
单细胞领域企业一览表：
总的来看，海内单细胞技能领域紧张集中在单细胞测序技能平台的研发，构建核心技能壁垒上，专注供应单细胞生信剖析做事的企业较少，单细胞蛋白领域较少企业涉足，仍具备一定的市场空间。
运用
单细胞测序技能已经在科研领域得到了广泛运用，最为直接的是用于肿瘤免疫的转化医学研究、伴随诊断和用药辅导。包括肿瘤免疫治疗的评估、伴随诊断、疗效评估，肿瘤个性化用药辅导，肿瘤及疾病标志物、细胞类群变革鉴定等。
例如，肿瘤新抗原疗法是单细胞测序技能与临床运用进行早期结合的一个运用方向。肿瘤新抗原是一种个体化的治疗方案，每个人的肿瘤细胞都有特异性的抗原，研究职员由此预测新抗原，并进行针对性治疗。
新抗原的存在性和抗原性检测是基于DNA而非基因表达做出的，这就须要结合单细胞测序来确定新抗原的表达强度，从而实现快速筛选。
又如，在液体活检领域，复旦大学生物医学研究院的施奇惠教授研究创造，CTC（循环肿瘤细胞）检测可以用于肿瘤早筛以及肿瘤转移检测，但CTC细胞具有异质性，不同技能路线将捕捉到不同纯度、亚型的CTC，就难以通过检出的CTC来判断肿瘤是否转移。
通过单细胞测序技能可以检测并分辨出极为微量的CTC，有望发掘CTC的临床代价。
单细胞测序在还可以运用于微生物研究，神经科学、免疫学等领域，详细包括：
1、 用于新物种鉴定、病原进化、耐药检测、临床诊断等微生物剖析
2、 用于探索神经元细胞亚型及其与阿尔兹海默症、帕金森、精神分裂症、烦闷症等疾病的产生发火机制等神经科学剖析。
3、 精确检测单个免疫细胞的遗传物质，剖析单个免疫细胞而非组织群体免疫细胞在免疫机制中的浸染等的免疫学领域研究。
单细胞蛋白组学在肿瘤免疫治疗也具有的运用潜力，紧张运用包括：
1、 通过检测血液蛋白，探求癌症早期诊断以及辅导分子靶向治疗的生物标志物组合。
2、 探索免疫疗法的细胞通路，浸染机制，预测治疗反应。
当然，单细胞蛋白组学的运用并不局限在肿瘤免疫领域，在免疫学、干细胞、疫苗研究等多个领域都已运用于根本研究、药物开拓以及转化研究。以下我们将列举单细胞领域企业，理解单细胞多组学在科研、临床的运用以及家当化现状。
10x Genomics
10x Genomics成立于2012年，公司面向环球供应单细胞测序设备，目前已经推出单细胞测序平台GemCode、Chromium。个中，Chromium平台增加了单细胞转录组建库的功能，一次建库测序最多可得到6000个细胞的单细胞转录组数据。10X正在与Agilent互助，共同研发外显子组单细胞测序产品。
2018年，10x 先后收购了表不雅观遗传学公司Epinomics和空间基因组技能公司Spatial Transcriptomics，以此完善其在RNA测序中的能力。2019年9月，10x Genomics在纳斯达克上市，IPO3.9亿美元。
万乘基因
万乘基因成立于2018年，专注于自主研发高通量单细胞测序平台，包括微流控设备、微液滴芯片、多组学试剂、剖析软件等，可以单次并行剖析一万个细胞。
万乘基因已经完成500万元天使轮融资，除转录组、ATAC外，公司最新研发的产品涵盖了单细胞甲基化、ChlP等表不雅观组学领域。与美国上市单细胞测序公司10x Genomics比较，万乘基因不仅是单细胞测序上游的仪器设备和试剂供应商，还面向终端用户供应系统的单细胞研究办理方案，包括从研究设计，样品制备到生信剖析的全套做事。
目前，万乘基因正在与多家免疫干系公司探索单细胞测序技能在抗体开拓、TCR筛选、新抗原检测中的运用。
宸安生物
宸安生物成立于2015年，专注于自主研发质谱流式细胞技能平台，实现高通量单细胞蛋白剖析。平台包括核心试剂，用于标记细胞蛋白的独特的金属标记抗体，设备仪器，以及质谱数据剖析软件。
公司已完成数千万元A+轮融资，不同于国外对标企业Fluidigm的质谱流式平台（初由DVS Sciences研发，后被Fluidigm收购），宸安生物开拓的质谱流式技能平台聚焦临床运用。
宸安生物的高效质谱流式细胞技能能够实现单细胞的50种蛋白质表达水平剖析，并聚焦于血液系统疾病的诊断和肿瘤免疫疗法的诊断产品开拓。
总结
只管微流控技能、测序技能、质谱流式细胞术的发展实现了在单细胞水平的遗传物质、蛋白剖析与检测，并广泛运用于科研领域，但要将其家当化，仍面临不少寻衅。
百度风投认为，单细胞检测与剖析家当化难点有三处：
1、工程迭代周期长，技能实现到工程稳定再到下贱运用剖析全链条实现，单细胞多组学剖析的质量受单细胞捕获效率、试剂体系、设备通量和精度等条件制约，涉及微流控技能、极微量剖析定量、海量生物数据剖析等核心技能，对团队综合能力哀求极高；
2、单细胞检测本钱高，单细胞多组学剖析是一个综合系统的工程，从单细胞样品制备、分离捕获，到上机基因测序或蛋白检测，原来一份Bulk样本的检丈量变成了一万份单细胞样本，当前的利用本钱仍不适宜大规模临床采取；
3、数据剖析与临床需求结合难度高，单细胞剖析将得到更为繁芜的基因、蛋白数据，这些数据与临床表型有若何的关联，如何进行剖析，这些都是单细胞生信剖析的难点。因此，要将单细胞多组学研究大规模运用，须要从整体水平，各个环节降落本钱，战胜技能壁垒，并找准单细胞数据与临床的契合点。
协力投资指出，单细胞测序的核心在于测序前处理，个中难点在于如何形成规模效应，及时处理样本，富集测试工具细胞，然后在单细胞水平精准标注、区分不同的细胞，形成单细胞水平、分子水平的标签，这对样本处理来说是极大的寻衅。
此外，单细胞水平数据剖析与细胞团层面的数据剖析比较，数据维度更高，每个单细胞数据都将可能成为数据剖析的新的维度，这也让单细胞测序数据剖析难以有所打破。
在家当化方面，单细胞测序有两个极具前景的家当化机遇，一是单细胞测序仪器的设计和开拓，这一点，10x Genomics便是范例；另一个是临床的运用，即通过不断的升级迭代，降落单细胞测序用度的本钱，让单细胞测序价格达到临床可接管或可支付的水平，终极在临床得到大规模运用。
从2009年到2019年，经由十余年的发展，随着基因测序本钱降落，微流控、质谱流式细胞术等核心技能取得打破，基于单细胞水平的遗传物质、蛋白剖析已广泛运用于免疫、微生物研究，神经科学等科研领域。
但单细胞剖析囿于本钱高、门槛高、剖析难并未达到大规模运用的程度，目前更多用于占领肿瘤、免疫等疾病领域的难题。单细胞领域企业适才起步，在多组学剖析中大多集中在转录组、蛋白组领域。
可以预测的是，随着10x Genomics的上市，单细胞多组学研究的深入，基因测序本钱进一步降落，基于单细胞水平的测序、蛋白剖析极具发展潜力，为人们认识疾病、理解免疫机制、药物创造等供应新的视角与方案。
更多精彩内容，关注钛媒体微旗子暗记（ID：taimeiti），或者下载钛媒体App
