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肺癌是癌症去世亡的紧张缘故原由，2020 年环球约有 180 万人去世于肺癌。只管包括靶向治疗和免疫治疗在内的治疗策略越来越多，但很少有患者能得到完备缓解，而且患者的反应也千差万别。人们已经认识到，肿瘤异质性和肿瘤微环境（TME）是导致肿瘤发展和抗癌治疗效果不佳的缘故原由。肿瘤微环境由细胞外基质（ECM）和各种细胞身分组成，包括免疫细胞和基质细胞。癌症干系成纤维细胞（CAFs）是TME中的紧张基质细胞，具有驱动癌症转移和耐药性以及调节免疫微环境的能力。TME在每个患者之间和患者内部都存在很大差异，导致疾病的多样性，并对精准治疗和药物开拓构成重大寻衅。因此，在体外重修具有肿瘤异质性和个性化 TME 的癌症模型已成为癌症研究和精准医疗的关键问题。虽然，癌症模型在癌症根本研究和精准医疗中发挥着至关主要的浸染。然而，目前的体外癌症模型因无法仿照体内肿瘤的三维构造和异质性肿瘤微环境（TME）而受到限定。
来自清华大学的古槿和熊卓团队利用基于微注射策略的液滴微流体技能开拓了一种创新的患者特异性肺癌凑集体（LCA）模型。这种方法能精确操作临床微量样本，并通过将患者肿瘤来源的TME细胞和肺癌器官组织均匀地包裹在微凝胶内，快速天生批内大小和细胞组成具有良好同等性的LCA。LCA再现了亲代肿瘤的瘤间和瘤内异质性、TME细胞多样性以及基因组和转录组景不雅观。与癌症器官组织比较，LCA模型可以重修癌症干系成纤维细胞的功能异质性，并反响TME对药物反应的影响。值得把稳的是，LCA 能准确复制患者的临床结果，这表明 LCA 模型具有预测个性化治疗的潜力。总之，本研究为精确制造癌症组装体供应了一种有代价的方法，也为癌症研究和个性化医疗供应了一种有前景的LCA模型。干系事情以题为“A patient-specific lung cancer assembloid model with heterogeneous tumor microenvironments”的文章揭橥在2024年04月20日的国际顶级期刊《Nature Communications》。
1. 创新型研究内容
本研究报告了一种创新的患者特异性肺癌组装体（LCA）模型，该模型是通过基于微注射的液滴微流控技能天生的，可实现临床微样本的精确操作和高通量天生 LCA（图 1）。LCA 是通过将患者肿瘤衍生的 TME 细胞和肺癌器官组织（LCO）均匀包裹在具有良好细胞相容性的明胶甲基丙烯酰（GelMA）-Matrigel 微凝胶中实现的。这种 LCA 模型在大小、细胞组成和药物反应谱剖析方面具有良好的批内同等性。此外，这些LCA代表了其亲代肿瘤的TME和肿瘤异质性，并复制了肺癌患者的临床反应，突出了本研究的LCA模型在根本研究和个性化药物筛选方面的潜在用场。
【通过基于微注入策略的液滴微流体技能建立均匀的生命周期评估】
癌症凑集体的兴起为癌症研究供应了一种前景广阔的工具。为了以高通量的办法天生具有个性化TMEs的均匀LCA，本研究基于创新微注射策略的微流控技能开拓了一个LCA平台。该平台专为细胞负载 GelMA-Matrigel 操作而设计，紧张包括生物墨水制备和 LCA 天生过程（图 1a，b）。本研究共网络了 49 份临床肿瘤样本，并利用液滴微流控技能将 36 名患者的肿瘤衍生细胞（LCO 和 TME 细胞）用于制造 LCA。成功地为 35 名患者制作了 LCA，成功率达 97.2%。LCOs 和 TME 细胞被封装到优化的 GelMA-Matrigel 水凝胶中，以 4 × 107 mL-1 的细胞密度制备生物墨水。微注射模块专为微样品操作而设计，包括一个内径为 500 μm 的硅胶管，用于将生物墨水吸入管中。生物墨水通过空气与增效试剂 PBS 分离，以防止被稀释。管子的末端可连接到成型模块，即一个 T 型接合芯片，在该芯片中，含有细胞的水凝胶随后被矿物油剪切成单分散液滴（图 1b）。生物墨水和油相的流速分别优化为 1 mL 和 5 mL h-1，以形成大小为 400-500 μm、包裹一定数量细胞（如 1500-2500 个细胞）的均匀凑集体前体。随后，用可控的紫外线强度对液滴进行紫外光交联，形成稳定的细胞负载微凝胶（LCA 前体），经由 3 天的培养，可长成具有患者特异性 TME 的 LCA（图 2a-c）。
图1 患者特异性肺癌凑集体（LCA）模型
为天生具有良好机器性能和生物活性的 LCA，选择了 GelMA 和 Matrigel 复合水凝胶，由于 GelMA 水凝胶具有出色的加工能力、可调机器性能和生物相容性，乃至可用于免疫细胞，而 Matrigel 水凝胶可为患者衍生的器官组织供应良好的肿瘤微环境。对材料配比进行了优化，以确保良好的生物相容性和成型性。压缩机器性能剖析表明，由 15%（v/v）Matrigel 和 6%（w/v）GelMA 组成的水凝胶在 405 纳米 90 mW蓝光照射 40 秒后显示出与患者肺部肿瘤相称的机器性能（19.1 ± 0.4 vs. 27.9 ± 3.9 kPa）（图 2d）。更主要的是，与 6-0（6% GelMA）和 6-30（6% GelMA 加 30% Matrigel）水凝胶比较，6-15 水凝胶保持了良好的细胞活力和细胞增殖能力（图 2e-g）。
图2 通过基于微注入策略的液滴微流体技能建立均匀的生命周期评估
【LCAs 保持了亲代肿瘤的异质性组织学和 TME 特色】
肿瘤具有瘤间和瘤内异质性特色，包括但不限于细胞和组织学异质性。来自同一患者或不同患者的 LCA 表现出异质性形态，表明患者的肿瘤间和肿瘤内异质性得以坚持。为进一步评估 LCA 在组织学层面上是否与其相应的亲代肿瘤相似，本研究进行了组织学剖析。苏木精和伊红（H&E）染色结果显示，LCAs的组织学特色与亲代肿瘤相似（图3a）。如箭头所示，基质细胞（赤色箭头）包裹着肿瘤细胞（玄色箭头），并相互形成连接。来自不同患者腺癌（AC）的 LCA 保持了癌细胞分解程度的瘤间异质性，EpCAM、细胞角蛋白 7（CK7）和 Ki67 的表达模式也在 LCA 中得以保留（图 3b）。
为进一步确定LCA中TME的特色，利用TME细胞的特异性标记物进行了免疫组织学剖析。在 LCAs 中不雅观察到了异质性细胞，包括 EpCAM+ 肿瘤细胞、α-SMA+ CAFs 和 CD45+/CD3+ 免疫细胞（图 3c、d），这表明 LCAs 可以再现亲代肿瘤的某种肿瘤微环境。特殊是，与常日用于天生三维球形肿瘤模型的 U 底超低附着微孔板（ULA）中的共培养比较，液滴微流控技能天生的 5 例患者的 LCA 在形状、细胞分布和 TME 坚持方面表现得更为均匀。Ki67 和缺氧探针染色显示肿瘤细胞增殖良好，LCAs 内没有明显的肿瘤缺氧区。本研究的 LCAs 较小（400~500 μm），可能有助于氧气和营养物质的运送，因而可以根据研究须要增加 LCAs 的大小来仿照肿瘤缺氧梯度。
图3 LCA 保持了亲代肿瘤的异质性组织学和 TME 特色
【LCA 保持了亲代肿瘤的转录组和基因组特色】
为确定LCA是否保持了其相应亲代肿瘤的转录组构造，对 4 例患者（LC14、LC28、LC51 和 LC52）的样本进行了大量 RNA 测序（RNA-seq），包括肿瘤样本、作为参考的相邻匹配正常肺组织，以及从培养 3 周（LC28 和 LC51）至 12 周（LC14）的肿瘤组织细胞中提取的相应 LCA。全转录组比较表明，LCA 与其相应的亲代肿瘤具有高度相似性，总体干系系数为 0.86。然而，随着癌症器官组织和 TME 细胞培养韶光的延长，相似性降落了（LC28 和 LC14 中基因表达的干系系数分别为 0.9 和 0.75）（图 4a），这与器官组织中的相似性同等。在所有亲代肿瘤和相应的LCA中，对LCA（相对付正常）和亲代肿瘤（相对付正常）中的上调基因进行了通路富集剖析。结果表明，亲代肿瘤或 LCA 中前 20 个富集通路在相应的 LCA 或亲代肿瘤中也高度富集。四对LCA-亲代肿瘤中基因上调的共同富集通路紧张涉及有丝分裂细胞周期、细胞增殖、上皮细胞分解和细胞外基质组织等生物学过程（图4b）。下调基因的共同富集通路紧张与 ECM 和循环系统有关（图 4c），这也是肿瘤与相应正常组织的一些紧张差异特色。对 LCA 与亲代肿瘤进行系统比较后创造，两者的紧张差异在于参与上皮细胞增殖、炎症反应和创伤反应等生物过程的基因上调，而与循环系统过程和 ECM 组织干系的基因下调。这些不同的富集路子可能表明，LCAs 坚持了免疫微环境，但相对缺少血管。此外，标记基因表达剖析表明，LCAs 及其原发肿瘤在癌症干细胞干系基因（如 SOX2、SIX2、EPHB2）、CAF 干系基因（FAP）、ECM 干系基因（如COL3A1、COL5A2、COL10A、VCAN）、免疫细胞干系基因（如 CXCL8、CXCL6、TNFSF11、IL4I1）和癌细胞干系基因（如 TOP2A、ASPM、S100P、RRM2）（图 4d），这表明 LCAs 在很大程度上保持了亲代肿瘤的细胞异质性。
图4 LCA 保持了亲代肿瘤的转录组和基因组特色
【LCA 保持了亲代肿瘤的细胞类型异质性和细胞间相互浸染特色】
为进一步研究细胞类型异质性和细胞-细胞相互浸染特色，本研究对2名患者的亲代肿瘤和培养1周和2周的相应LCA进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）剖析。首先整合了六个数据集中的所有细胞，确定了六种紧张细胞类型，包括上皮细胞、成纤维细胞、T 细胞、B 细胞、肥大细胞和巨噬细胞（图 5a）。上皮细胞可进一步聚类为 6 个亚型（如上皮基底细胞、AT2 样细胞、AT2 细胞、棒状细胞和处于增殖状态的细胞），成纤维细胞和 T 细胞均聚类为 2 个亚型（非增殖细胞和增殖细胞），表明这些样本中存在肿瘤和 TME 异质性（图 5b）。除上皮细胞外，LC55 和 LC66 在紧张细胞类型上都显示出细胞聚类的相似性（LC55 中富集了基底细胞和俱乐部细胞，而 LC66 中富集了 AT2 样细胞和 AT2 细胞）（图 5c），表明患者的上皮细胞存在很大的异质性。值得把稳的是，患者肿瘤的所有细胞类型在相应的 LCA 中都保持良好，1 周龄的 LCA 中细胞类型的比例与亲代肿瘤相似，而 2 周龄的 LCA 中细胞类型与亲代肿瘤的相似度较低（图 5d）。
图5 LCA 保持了亲代肿瘤的细胞类型异质性和细胞-细胞相互浸染特色
【LCA 模型可重修和识别功能异质的 CAF】
本研究根据 HGF 和 FGF7 的分泌水平确定了一组 7 例患者特异性 CAFs 的异质性，HGF 和 FGF7 在放射抗性、化疗抗性和表皮成长因子受体抑制剂抗性的形成中发挥着重要浸染。本研究创造了异质性 CAFs，包括 HGF 高 FGF7 高/低表达亚型（LC05、LC17、LC22、LC19 和 LC27）和 HGFlowFGF7low表达亚型（LC23）（图 6a，b）。在这些来自不同患者的肿瘤中，CAFs 的分布和比例具有异质性（图 6c）。接下来，用患者来源的 LCO 和相应的 CAF 天生了 LCA，以评估 CAF 对肿瘤成长和肿瘤对药物治疗反应的影响。封装在微凝胶中的 LCOs 被用为难刁难照组。本研究不雅观察到了 CAFs 对匹配肿瘤细胞的不同影响。HGF 高表达 FGF7 高 表达的 LC22 CAFs 显著促进了 LCA 中癌症组织细胞的成长（图 6d，e），并改进了 LCA 对化疗药物（紫杉醇）治疗的耐受性（图 6f）。
图6 LCA 可重修和识别功能异质的 CAF
【LCA 作为个性化药物测试的强大临床前模型】
本研究剖析了异质性药物反应的反响以及平行实验中各孔 LCA 细胞活力的同等性，对患者的 LCA 和相应的 LCO 进行了大规模的细胞活力测试。从剂量反应曲线和LogIC50值来看，LCA和LCO都能再现患者间和患者内对临床上常用的肺癌化疗药物反应的异质性（图7a、b）。然而，LCA 组和 LCO 组之间的药物反应仍有显著差异。例如，LCO36对PC（培美曲塞+卡铂）和TC（紫杉醇+卡铂）均敏感，而LCA36对PC耐药。此外，与 LCOs 比较，大多数 LCAs 对化疗药物和靶向药物的反应降落（图 7b），这与之前的研究类似。这些差异可能是由 LCAs 中存在的肿瘤微环境造成的，它可能反响了具有微环境的肿瘤对药物的真实反应。
图7 LCA 作为个性化药物测试的临床模型
2. 总结与展望
总之，本研究供应了一种高通量天生统一癌症组装体的可行方法，以及一种复制患者特异性 TME 和亲代肿瘤其他关键特色的个性化临床前模型。该模型具有测试个性化治疗反应的潜力，可广泛运用于根本研究和转化研究。该模型和未来的调度可能会推动临床-转化事情，以开拓肺癌的联合疗法和个性化疗法。
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