研发者必读：关于中国干细胞药物CMC的思虑_细胞_干细胞

与多能干细胞比较，成体干细胞的增殖和分解能力有限，但分解方向明确。

胎儿干细胞比成人干细胞具有更高的增殖能力，但胎儿组织来源有限，不稳定，涉及繁芜的伦理问题，因此未得到广泛运用。

从监管角度来看，美国食品和药品监管局（FDA）尚未批准市场上的任何干细胞产品，而FDA监管的干细胞产品正在进行数百项临床试验。

自2009年以来，欧洲药物管理局（EMA）批准了市场上的自体干细胞治疗产品，如软骨细胞移植、Holoclar，并且没有批准hPSC衍生的干细胞产品。

2014年，日本完成了第一次自体hiPSC衍生视网膜色素上皮细胞移植以治疗黄斑变性，并于2017年在日本卫生、劳动和福利部的监督下完成了第一次同种异体hiPSC细胞移植。

在中国，目前有两种监管方法来监督干细胞临床研究。
一种方法是利用“双重归档系统”网络由国家医药产品管理局和国家卫生委员会共同管理的干细胞研究医疗机构和年夜夫发起的临床研究项目的文件。
另一种方法是，申办方可以将研究新药（IND）提交给国家医药产品管理局药物评估中央（CDE），如果没有提出异议，则在60个事情日审查后许可进行临床试验。
在IND档案中，可以供应先前由年夜夫发起的临床研究数据，以支持细胞产品的安全性和有效性。

CMC对干细胞产品的研究紧张集中在制造和质量掌握方面。
从制造业的角度看，干细胞的分离、体外培养和勾引分解技能实现了向各种功能细胞的可控分解，处于特定分解阶段的细胞（如早期前体细胞、成熟功能细胞等）是中间细胞产物。
供体对供体的变革和干细胞产品的批次对批次的变革使得很难确定得当的制造工艺和质量标准。
大规模生产是一项寻衅。
根据现有的科学知识和临床履历，来自不同来源的细胞差异很大，并且各种细胞类型的风险水平也不同。
例如，hPSC衍生细胞产品的临床运用的缺陷是，由于其多分解潜能和四瘤形成能力，其理论致瘤风险显著较高。

本文综述了目前在中国的干细胞产品规范中考虑的要点。
利用生命周期管理策略解释了详细考虑事变，包括原材料和辅料的管理、制造过程、质量研究和掌握、稳定性、包装和装运（图1）。

原材料、起始材料和辅料

应严格审核原材料，并制订内部规范。
原材料应追溯至采购、制造、包装、储存和运输全过程。
对付直接打仗细胞的材料（比如细胞因子、化学分子、抗生素、磁珠或基质凝胶），首选医药级或临床级材料。
对付研究级试剂（包括培养基、肽、抗体、消化酶、血清），应清楚其组成，并建议进行全面测试以确保质量。
ROCK抑制剂（如Y27632），常日在干细胞消化过程中添加，以减少细胞去世亡。
鉴于在永劫光传代期间，添加ROCK抑制剂对细胞的影响尚不清楚，建议供应支持数据来阐明其利用的合理性。

避免利用动物源性材料，除非有正当情由，并且无需任何外来病毒污染的证明。
应明确添加血清的必要性和剂量的合理性，并进行残留血清检测。
鼓励在干细胞产品制造中利用无血清和化学定义的细胞培养用血清替代品。
建议选择合成消化酶替代动物源性材料。

▉喂养层细胞

许多干细胞传统上是在失落活的喂养层细胞上培养的（如经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞/人成纤维细胞）。
随着2D和3D培养的遍及，目前已利用细胞外基质（如Matrigel、Geltrex和Vitronectin等）建立了无喂养层培养系统。
建议利用化学定义的基质，以防止动物源性材料的有时污染。
例如，Matrigel来源于小鼠肿瘤细胞，如果利用，则须要对小鼠病毒进行全面测试，并对致瘤性进行风险评估。
如果利用馈电单元，应建立单元组并进行彻底测试。
应研究和验证辐照剂量和其他细胞失落活过程，以保持喂养层细胞的批间质量同等性。

起始材料指用于制造干细胞产品的供体组织/细胞。
根据现有的监管指南，捐赠者筛查应包括对各种病理学和遗传病的检测。
对付以hPSC为起始质料的产品，应供应hPSC生产线的来源和建立文件，应根据GMP建立hPSC细胞库，应明确规定细胞代次或细胞倍增韶光，应参照国际标准对细胞库进行全面测试。
应进行细胞系稳定性研究，包括细胞培养性能和遗传剖析，以支持细胞系的同等性超过建议的累积群体更加限定。

细胞产品常日含有冷冻保存剂（包括PBS、DMSO、HSA等），建议在配方中加入药用辅料。

针对IND阶段，必要时须要对未广泛利用的赋形剂进行毒性研究和评估。
针对NDA阶段，辅料须要注册，技能审查将根据2020年7月生效的最新中国药品注册法规并行进行。
某些干细胞产品涉及递送装置，包括避免免疫攻击的封装技能，或支持体内细胞成长的支架。
在中国，干细胞产品的设备部分将由NMPA医疗设备评估中央（CMDE）共同审查。

3.制造工艺

用于人体临床试验的细胞产品必须按照GMP生产。
常日，干细胞产品的制造过程包括供体细胞分离、细胞扩增、细胞库建立、细胞分解、纯化、配方、冷冻保存、储存和运送。
应彻底研究工艺开拓和优化、关键步骤和中间体的掌握、杂质的去除。
工艺流程和参数的基本事理将在IND运用期间进行技能审查。

4.过程开拓

在开拓的早期阶段，常日采取实验室规模的制造工艺，例如利用小型培养皿/烧瓶生产数量有限的细胞。
在这种情形下，很难确保此类制造过程的再现性、无菌操作的掌握、产品质量掩护。
对付临床批量生产，建议优化工艺，调度规模，保持批间质量同等性，以知足临床试验须要。
大型细胞培养设备常日包括平底多层培养瓶（细胞工厂）、贯注生物反应器、搅拌生物反应器等[5]。
多层细胞工厂可生产高达1010-1012个细胞，有限培养面积的贯注式生物反应器可生产约108个细胞。
建议根据所需剂量、培养方法（单层培养、悬浮培养或2D、3D培养）、培养基变革频率以及是否须要实时pH或O2监测来选择用于临床批量生产的细胞培养设备。

在培养临床级hPSCs的过程中，细胞克隆的选择和分解细胞的去除至关主要。
嵌合克隆和非常增殖克隆应在传代前鉴定并去除，否则细胞培养系统中可能会涌现大量非常增殖细胞。
在传代操作方面，克隆机器分离、化学/酶消化等可运用于hPSC。
消化后的细胞块大小、传代率、机器力强度、消化酶浓度和离心力以及培养基变革、细胞因子、pH、CO2浓度、细胞密度都是可能的关键工艺参数。
细胞密度、克隆形状、边缘平滑度可能是监测hPSC未分解状态的关键指标。
主要的是，应仔细研究和限定hPSC的通道数。
hPSC细胞在长期培养（例如几个月）中随意马虎积累基因突变，具有特定突变的细胞的快速成长可能导致克隆异质性，乃至形成显性克隆[6]。
因此，一样平常建议在hPSC细胞扩促进程中缩短韶光，限定传代次数，并在细胞状态稳定时及时冻结hPSC细胞库。

许多MSC都是大规模生产的。
同样，限定骨髓间充质干细胞的传代数量也是至关主要的。
随着传代次数或培养韶光的增加，建议剖析MSC形态、增殖特色、染色体、致瘤性和癌基因突变的发生情形，以明确体外细胞扩增的韶光和传代限定。
值得把稳的是，MSC的长期培养可能有细胞恶性转化的风险。
例如，研究表明，骨髓来源的骨髓间充质干细胞体外培养106周后，其形态、增殖率、表型和分解能力发生了显著变革，抑癌基因p16和p21启动子区域的甲基化增加，细胞移植到免疫毛病小鼠体内后可形成肿瘤样组织[7]。
由于高代细胞更随意马虎发生恶性转化，建议缩短培养韶光，持续监测细胞倍增韶光和遗传表型。

主要的是，IND档案中须要临床/毒性批次的制造程序和标准操作规程以及详细参数。
随着临床试验的进行，可以进一步深入研究过程和过程验证的稳健性。

5.过程掌握

大多数开放式制造系统和半封闭式系统都须要适当的过程中生物负载掌握，以避免污染或交叉污染。
如有必要，还应监测细胞的遗传稳定性、特异性不定病毒或其他细胞类型的可能污染。
与干细胞干系的重编程和分解过程常日包括许多分解阶段、遗传操作、频繁的培养基置换操作和长期培养韶光。
精确掌握生产过程中不同阶段（生殖层阶段、前体细胞阶段、中间分解阶段和终末分解阶段）的细胞命运是一项重大寻衅。
人类利用的终极干细胞产品紧张由前体细胞或终末分解细胞组成。
在某些情形下，须要防止这些细胞在培养系统中进一步分解/转分解。
因此，建议在适当的韶光点掌握每个阶段细胞的分解潜能和标记物表达。
例如，建议在细胞分离后对细胞特性和生存能力进行表征，收成前可在细胞上检测细胞标记物、杂质（残留抗生素和细胞因子等）、分解能力或细胞因子分泌活性等指标，以确保细胞质量符合哀求。
此外，应仔细评估供体细胞库和细胞收成的致瘤性风险。

6.配方工艺

应根据预期给药路子明确解释每种赋形剂的基本事理，并评估赋形剂与细胞之间的相容性。
如果主理方提及上市细胞产品的配方，则须要通过稳定性数据评估和支持配方的适用性。
在早期的小规模配方工艺开拓中，常常利用手动添补工艺。
生产设备、职员操作、冷冻保存和转移管理应设计良好，以确保临床批次不受任何污染。
人工灌装时应把稳担保细胞含量的同等性和均匀性。
应加强过程掌握，确保无菌生产过程得到监控。
在进行大规模生产时，鼓励开拓自动化灌装工艺，以确保安全性和质量同等性。

7.质量研究和掌握

干细胞产品的质量表征和掌握涉及微生物安全性、特性、分子标记、效力、纯度和杂质。

8.微生物安全

关于临床受试者严重不良反应的大量报告表明，不良反应紧张是由于干细胞产品的微生物污染，包括细菌、真菌、支原体和细菌内毒素的污染。
干细胞给药前的微生物检测是确保患者安全的主要掌握方法。
如今，广泛利用的BacT/Alert 3D自动培养系统等快速无菌检测方法缩短了培养韶光，并且在检测能力方面与药典方法没有显著差异[8]。
支原体快速检测方法包括核酸扩增技能和支原体代谢酶活性检测。
在中国，如果替代方法未得到充分验证，建议同时利用无菌和支原体检测的药典方法进行开释检测。
当开释试验仅利用快速开释方法时，须要根据药典验证剖析适用性和性能，以证明快速开释方法可以取代药典方法。
对付可能含有残留抗生素的产品，应在验证中评估抗生素对无菌检测的抑制浸染。

9.身份和分子标记

干细胞的身份可以通过细胞形态学不雅观察、干细胞标记物检测、STR、体外分解潜能剖析、畸胎瘤形成实验等来检测。
利用STR验证细胞来源时，建议在尽可能多的STR位点比较受试细胞和原始细胞（或衍生细胞）的基因分型结果。

从学术角度来看，随着生命科学的发展，许多类型的干细胞没有得到彻底的表征，新的标记物不断被创造。
干细胞标记物的表达受多种成分影响，如供体变异、标记物在细胞内的分布、分离和培养操作、培养基组成、细胞分解阶段和不同的朽迈水平。
例如，在通过不同重编程方法产生的hiPSC细胞中不雅观察到不同的干细胞标记物表达水平和分解潜能[9]。
当细胞暴露于特定成长因子或缺氧等培养条件下时，干细胞标记物发生变革[10]。
因此，文献中报告的特定类型细胞的标记物可能不会涌如今生产细胞批次上。
建议资助商研究临床批次的分子标记物，并选择能够识别功能细胞类型的紧张代表性标记物。
对付分子标记物的剖析，常日利用流式细胞术、免疫荧光法。
试验方法应表明标记物在细胞中的分布，应采取细胞培养和试验的标准操作方案、抗体的来源和类型以及适当的阴性和阳性对照。

10.致瘤性剖析

干细胞产品的致瘤性是阻碍其临床转化的紧张成分。
多种路子可导致肿瘤形成。
一方面，干细胞增殖分解过程中的恶性转化可能导致肿瘤的形成；另一方面，终极产物中残留的未分解干细胞可能形成畸胎瘤，尤其是hPSC衍生的细胞产物。

致瘤性检测方法包括畸胎瘤形成剖析、软琼脂剖析、核型剖析（G显带）或荧光原位杂交（FISH）等。
建议在细胞培养阶段、细胞库试验和开释试验中利用正交法检测细胞的致瘤性。
对付染色体剖析，剖析细胞的数量对剖析的灵敏度至关主要。
根据中国药典，至少50个中期细胞应进行核型显微镜剖析，大约500个中期细胞运用于检讨多倍体的发生率。

根据1700个hiPSC和hESC细胞的核型剖析数据，一些核型非常的hiPSC和hESC细胞系可能具有相似的染色体变异特色，如12号染色体重复[9]。
对付hPSC产品，建议进行全面的遗传剖析，包括染色体拷贝数变异剖析（CNV）、FISH、外显子测序、单核苷酸多态性阵列或单细胞测序技能等，以检测遗传变异。
对付恶性转化问题，建议深入研究生产工艺和产品质量掌握，持续监测细胞染色体稳定性。

目前，据宣布，去除hPSC的方法包括添加小分子抑制剂以特异性勾引hPSC去世亡/凋亡[11]，或利用苛刻的培养条件（如缺氧、低葡萄糖等）去除干细胞并富集终末分解细胞[12]。
对付hiPSC衍生产品，在hiPSC重编程过程中利用安全开关，例如自尽基因与转录因子基因的领悟，也是避免转录因子持续表达从而降落肿瘤发生风险的可能办理方案。
然而，安全开关的引入也增加了外源基因整合的风险，利用时有必要仔细评估风险效益比[13]。
建议干细胞产品规范包括利用流式细胞术剖析、免疫组织化学或多潜能标记物（Myc、OCT4、SSEA4、Nanog等）定量聚合酶链反应剖析检测hPSC衍生产品中的残留干细胞。
对付体外多次传代的细胞，有限代内的低代、中代和高代细胞均需进行致瘤性和残留hPSC剖析，以降落肿瘤形成的风险。

11.纯度和杂质

干细胞产品中的杂质包括产品干系杂质和工艺干系杂质，影响产品的安全性和有效性，如残留的高风险材料和非靶细胞。
终极细胞产品中的非靶细胞常日包括喂养细胞、成纤维细胞、去世亡细胞、残留的种子干细胞和未知细胞。
如果无法准确检测每种细胞类型的含量，则应确定细胞的表型，并根据最大剂量进行安全性评估。
由于有限的制造履历、来源、制备工艺、给药路子的变革以及不同的临床需求，批量剖析数据可用于设定IND阶段非靶细胞百分比的验收标准。
对付与工艺干系的杂质，包括培养基身分、成长因子、消化酶、残留珠粒等，建议累积多个收成后批次的测试结果，或根据工艺参数（洗涤循环次数或稀释次数）打算理论残留量。
在运用IND之前，应进行杂质检测方法的初步验证。

12.效力

效价测定是为了空想地反响细胞产物的浸染机制（MOA），常日包括细胞替代治疗的体外分解潜能测定、功能蛋白表达测定、细胞因子分泌测定和生理活性测定。
一些产品打算用功能性细胞替代受损细胞或组织发挥浸染，而另一些产品可能通过分泌活性因子来实现体内功能。
因此，效力的研究须要个案评估。
替代相对效价试验也可用于MOA未知的产品。

在临床前阶段，虽然标准参考可能不可用，但建议建立具有可接管变革的低级效价测定。
干系技能方法包括免疫荧光染色、形态学不雅观察、流式细胞术剖析、电生理剖析等。
应设置阳性和阴性对照，并仔细设计效价检测前的细胞处理操作。
对付心肌细胞和神经细胞，电生理活性试验适用于丈量细胞产物的功效，但很难定量表征细胞功能。
动物模型也可用于丈量细胞产品的修复/再生能力，以评估体内的生物活性。
对付MSC细胞的免疫调节功能，科学界提出可以结合不同的方法（如核糖核酸定量剖析、标记物检测、分泌蛋白剖析和免疫细胞反应剖析等）来表征MSC细胞的免疫功能[14]。
此外，MSC的分泌含量是反响其旁分泌浸染的常见指标。

13.规格

制造过程的所有阶段都伴随着适当的过程中掌握[15]。
关于多能干细胞库的质量标准，可以从银行机构找到干系标准，包括中国国家干细胞资源库[16]、国际干细胞研究学会（ISSCR）和国际干细胞库倡议（ISCBI）[17]。
对付生产过程中中间产品的质量掌握，建议在不同韶光点检测安全项目（如无菌、支原体和内毒素）。
此外，建议密切监测细胞分解潜能和遗传稳定性。
就终极产品的规格而言，建议包括外不雅观、无菌、支原体、内毒素、外来剂、特性、致瘤性、细胞数量、细胞活力、纯度、效力、杂质残留量、非靶细胞等测试项目。
然而，在早期临床试验期间，有限的批次数量和少量的患者使得设置适当的规格具有寻衅性，并且在往后的开拓过程中可以进行更多的细化。

14.稳定性、包装和装运

干细胞产品的稳定性研究应涵盖所有制造阶段，包括供体组织采集、组织保存、组织/细胞运输、细胞库保存、中间细胞样品、冷冻保存和终极产品的利用稳定性。
建议利用具有代表性的细胞治疗产品样品进行稳定性研究，这些产品具有与临床批次相似的液体体积和细胞密度范围（如有）。
产品的运输稳定性研究紧张集中在从细胞网络地点莅临盆地点再到临床利用地点的运输过程。
应供应稳定性数据，以支持IND档案中的运输条件和韶光。

袋、管广泛用于包装干细胞产品，有时根据不同的给药路子涉及支架和设备。
为了避免免疫反应，封装也被用来包装细胞产品。
申请临床试验时，建议供应容器封闭系统的基本信息，如来源、质量规范和生物安全数据。
为确保临床利用的安全性，接管产品与由相同材料制成的小型容器/包装系统之间兼容性的初步评估。
应特殊把稳辅料（如二甲基亚砜）与容器之间的相容性。
如果容器封闭系统广泛用于包装电池产品，初步稳定性研究结果可用于评估包装材料的相容性。
在申请市场授权之前，应根据干系指南，根据身分、细胞配方、保存条件和设备完成完全的兼容性研究。

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MSCs 药物发展概况

3

适用于 MSCs 产品的法规和指南

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化学、制造和掌握（CMC）

干细胞产品的原材料多种多样，制造工艺繁芜，质量掌握方法千差万别。
在人类利用干细胞产品之前，须要不断努力提高干细胞产品的安全性/有效性。
目前，对供人类利用的干细胞产品进行长期风险评估的履历有限。
在增加干细胞产品进入临床试验之前，安全性评估至关主要。
只管hESC和hiPSC在理论上有可能产生各种类型的成体细胞，但由于培养基改换方案繁芜、操作程序繁芜、培养韶光长，在掌握分解过程中碰着了许多问题。
类器官、三维培养技能、气液界面培养、器官芯片和其他新的细胞/组织产品和技能也对制造过程的标准化提出了寻衅。
干细胞产品的CMC评价须要全面考虑在获取供体细胞或组织、生产过程、储存和运输、临床交付操作中引入的风险，以确保产品的有效生命周期管理。

对付利用病毒载体和其他基因转导系统进行基因工程以进行重编程和基因润色/重塑的干细胞产品，应把稳安全风险，如复制能力强的病毒、插入突变和癌基因激活。
对付静脉注射产品，肺部细胞的积聚和全身异位组织的形成是潜在的问题。

此外，目前还没有关于如何选择致瘤/致癌研究的动物模型的科学共识，由于得当的模型该当确保细胞能够在体内长期存活，以研究是否可能发生潜在的肿瘤形成。
应考虑生理学、解剖学、与人类的可比性、对人类细胞产物的免疫耐受性、给药路子的可行性、免疫毛病动物的适用性、患病动物等成分来论证模型的合理性。
值得把稳的是，在动物给药之前，细胞产品可能会经历一系列操作，如洗濯、传代和培养基改换。
因此，动物实验用供试品应作为临床批次同等对待。

中国最早的干细胞产品法规可追溯到1993年，当时中国卫生部发布了《临床研究用细胞和基因治疗产品质量掌握指南》。
2003年，中国食品药品监督管理局发布了《人体细胞治疗研究与质量掌握指南》[18]。
2015年，中国卫生和操持生养部与中国食品药品监督管理局联合发布了《干细胞临床研究管理指南》，并“干细胞医药产品和临床前研究质量掌握指南”，以规范干细胞临床研究和质量掌握。
2017年，中国食品药品监督管理局发布了“细胞治疗产品研究和评价指南”“，提出了细胞药物注册和运用的技能哀求。
2019年，更新了《中华公民共和国药品管理法》，强调了药物的生命周期管理。
建议建立一个强大的监测系统，以符合哀求。
2020年，但书更新了《药品注册条例》，规定市场授权持有人对药品开拓负有紧张任务，干系文件将首先解释细胞产品的档案哀求。

随着环球老龄化人口的增加和细胞治疗的快速发展，临床对再生药物的需求日益增长。
要成功地对再生医疗产品进行监管，须要有健全的原则。
对付发起人，尤其是初创公司，鼓励与监管机构进行早期互动，以大幅加快干细胞产品的发展。
只管须要做出更多努力来办理CMC问题并连续进行临床探索，但相信随着中国药品审查制度的持续改革政策和干细胞产品监管政策的逐步环球趋同[19]，以及细胞治疗科学生物学研究和家当的进步，将开拓越来越多的干细胞产品，使数百万医疗需求未得到知足的患者受益。

— 未完待续 —

长风破浪，一份关于“干细胞疗法发展进程”的完美总结

— END —

- 科普 情怀 任务 -