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导读
冬凌草（Isodon rubescens）因其抗肿瘤或抗癌特性而备受关注。然而，人们对利用小RNA和mRNA之间的调控网络合成冬凌草甲素的分子机制知之甚少。本研究结合mRNA、miRNA和降解组研究了miRNA和靶标的调控网络，共鉴定出348个miRNA，包括287个已知miRNA和61个新型miRNA。个中，51个miRNA有显著表达，36个miRNA对MeJA有反应。通过降解组测序，共有3066个靶基因与228个miRNA干系。多组学剖析表明，27个miRNA-mRNA对被推测参与了MeJA的调控，36个miRNA-mRNA对被推测参与了冬凌草的基因型依赖性。此外，研究者通过psRNA Target和降解组测序，分别创造151和7个miRNA-mRNA模块可能参与了冬凌草甲素的生物合成。一些miRNA-mRNA模块通过RT-qPCR得到了证明。此外，还创造了靶向植物激素旗子暗记转导通路基因的miRNA，如miR156、miR167、miR393和PC-3p-19822_242。总之，本研究结果首次证明了在冬凌草中创造了miRNAs，为进一步研究miRNA介导的冬凌草甲素生物合成的分子机制奠定了坚实的根本。
论文ID
原名：Multi-omics analysis of small RNA, transcriptome, and degradome to identify putative miRNAs linked to MeJA regulated and oridonin biosynthesis in Isodon rubescens
译名：冬凌草小RNA、转录组和降解组的多组学剖析确定了与MeJA调节和冬凌草甲素生物合成干系的假定miRNAs
期刊：International Journal of Biological Macromolecules
IF：8.2
揭橥韶光：2023年12月
通讯作者：陈随清
通讯作者单位：河南中医药大学药学院
DOI号：10.1016/j.ijbiomac.2023.129123
实验设计
结果
1 小RNA测序技能概述
为了全面鉴定冬凌草，并确定参与冬凌草甲素生物合成的miRNA对MeJA的相应，研究者从JY基因型（含冬凌草甲素）和LS基因型（不含冬凌草甲素）经MeJA处理或未处理的叶片中提取了12个sRNA文库、分别命名为JY_M0h1、JY_M0h2、JY_M0h3、JY_M3h1、JY_M3h2、JY_M3h3、LS_M0h1、LS_M0h2、LS_M0h3、LS_M3h1、LS_M3h2和LS_M3h3。测序后，共得到8289001至17899577个原始读数和4299777至10240103个纯净读数。研究者利用与Genbank和Rfam数据库的blastn和blastall比对，将小RNA注释到对MeJA有不同反应的冬凌草基因型。在JY文库中，最丰富的RNA种别是rRNA，均匀值为3.37%，其次是tRNA（2.59%）、其他Rfam RNA（0.17%）、snoRNA（0.05%）和snRNA（0.03%）。对付LS文库，注释结果类似，rRNA的代表性最高，均匀值为2.68%，其次是tRNA（1.30%）、其他Rfam RNA（0.14%）、snRNA（0.04%）和snoRNA（0.04%）（表1）。
不同长度的sRNA具有不同的功能。21-nts RNAs紧张在转录后基因沉默中发挥浸染，而24-nts RNAs常日通过异染色质坚持或RNA依赖性DNA甲基化勾引基因沉默。在剖析18至25nt长度的小RNA分布时，采取了干净的读数，个中21至24nt长度的sRNA数量最多（74.82%-90.00%）。然而，两组文库（JY文库和LS文库）的小RNA分布却有所不同（图1）。在JY文库中，长度为24nt的sRNA数量最多（占26.96%），21nt的sRNA数量在所有文库中位居第二（占26.64%）（图1A）。比较之下，在LS文库中，长度为21nt的sRNA数量最多（31.43%），明显高于第二多的长度为24nt的sRNA（24.84%）（图1B）。这一差异表明，不同基因型的冬凌草的sRNA存在功能差异。总之，这些结果表明在不同基因型的冬凌草中存在繁芜多样的sRNA群体。此外，sRNA作为表不雅观遗传调控因子，为研究不同地区中药的遗传机制奠定了根本。
图1.冬凌草不同文库中独特小RNA的长度分布。
表1.冬凌草不同文库中的小RNA分类。
2 通过sRNA测序鉴定miRNA
为了鉴定miRNA，研究者将干净序列标签与miRBase数据库中保存的所有植物miRNA成熟序列进行了比对。通过对属于99个科的12个文库进行测序，共得到287个已知miRNA（表S2）。miR156是最大的家族，有18个成员，其次是miR396和miR171，分别有16和15个成员（图2A，表S2）。此外，还研究了守旧miRNA的丰度。在所有文库的34个miRNA中，有20个miRNA家族的读数丰度超过1000。比较之下，只有9个miRNA的读数丰度超过10000个，52.96%的miRNA的读数丰度低于10个（表S2）。在鉴定了已知的miRNA后，研究者根据miREvo和miRdeep2标准鉴定了新型miRNA（表S3）。统共鉴定出61个新型miRNA，只有4个新型miRNA的读数丰度超过10000，分别命名为PC-3p-4_1276478、PC-3p-14_301914、PC-3p-122_22955和PC-5p-216_13956（表S3）。此外，还进行了核苷酸偏倚剖析，在所有miRNA中，共有51.42%的第一个核苷酸偏倚为U，其次是A（21.93%）、C（16.27%）和G（10.38%）（图2B）。在长度为18至23nt的miRNA中，U也是首选的第一个碱基，而在长度为24nt的miRNA中，首选的第一个碱基是A（图2C）。miRNA序列的这些特色与已知的Dicer处理特异性相吻合。
研究者评估了全体文库的miRNA分布情形，创造JY和LS基因型的对照组和MeJA处理组样本共有145个miRNA（图2D）。JY_M0h组、JY_M3h组、LS_M0h组和LS_M3h组分别检测到317、283、271和288个miRNA。在JY和LS基因型中，经MeJA处理的样本的miRNA种类呈现出相反的趋势。JY基因型的miRNA种类在MeJA处理后减少，而LS基因型的miRNA种类则增加，这反响了miRNA对冬凌草基因型的反应。研究者分别比较各基因型，JY基因型的对照样本和MeJA样本共有10个miRNA，mes-MIR167gp3、mtr-miR156e_1ss21CT和nta-MIR159-p5_2ss8GA18TC等26个miRNA是JY_M0h植株所特有的，而PC-3p-259822_16、PC-3p-256709_16等2个miRNA只在JY_M3h植株中表达。在LS基因型中，sly-miR167b-3p_R-3_1ss10AG、ly-miR395b-5p_1ss9TC和mtr-MIR166b-p5_1ss9GT等5个miRNA只在LS_M0h植株中表达、而mtr-miR172a_1ss21GT、mtr-miR398a-3p_R-1和aly-MIR857-p3_2ss11GC22AT等10个miRNA在MeJA处理后表达。此外，在LS基因型中，有11个miRNA在对照组和MeJA处理之间普遍表达（图2D）。
图2.通过sRNA测序剖析已知和新型miRNA。A：前20个已知miRNA家族；B：miRNA总核苷酸偏倚；C：不同长度miRNA的第一个核苷酸偏倚百分比；D：四组文库的韦恩图。
3 miRNA的表达剖析
研究者基于fold change（≥1或≤1）和P/q值（＜0.05）阈值，鉴定出348个miRNA中共有51个（14.66%）表达显著（图3A，表S4）。研究者对四组上调和下调的miRNA进行配比拟较。个中，JY_M0h组 vs LS_M0h组的显著miRNA数量最多（图3B，C）。与MeJA处理组比较，JY基因型产生了有27个miRNA对MeJA有反应，13个差异表达的miRNA（5个上调，8个下调），包括aly-MIR845ap5_2ss3CT21AT、mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC，在LS基因型中有15个差异miRNA（7个上调，8个下调），包括sly-miR167b-3p_R-3_1ss10AG,ppe-MIR171e-p3_2ss10GC20CT和stu-miR482a-3p_1ss8TC（图3D）。3D，表S5）。然而，只有1个miRNA（mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC）在JY_M0h.JY_M3h组和LS_M0h与LS_M3h组之间表现出共同的差异。这一结果表明不同基因型的冬凌草对MeJA的反应模式存在差异。在不同基因型剖析中，JY_M0h组 vs LS_M0h组有34个差异表达的miRNA（14个上调，20个下调），包括mtr-miR172c-5p、PC-3p-49776_106和mtrmiR159a_R-2。与LS_M0h比较，JY_M3h中有23个不同表达的miRNA（8个上调，15个下调），包括PC-5p-444_6890、mtr-MIR168c-p3和gma-miR160a-3p（表S6）。此外，在（JY_M0h vs JY_M3h）vs.（LS_M0h vs LS_M3h） vs （JY_M0h vs LS_M0h） vs （JY_M3h vs LS_M3h）的比较中，mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC也是常见的miRNA（图3C）。这表明mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC在调节冬凌草基因型差异的同时，也对MeJA作出了反应。
图3.冬凌草的miRNA表达剖析。(A）冬凌草中显著差异表达miRNA的热图。(B)不同比较组中上调和下调表达明显不同的miRNA的数量，P值＜0.01，P值＜0.05。(C)JY_M0h vs JY_M3h、LS_M0h vs LS_M3h、JY_M0h vs LS_M0h和JY_M3h vs LS_M3h的韦恩图剖析。(D)JY和LS基因型对MeJA的反应中表达的miRNA的显著差异热图。
4 靶标预测和降解组剖析
研究者利用psRNA Target做事器（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）预测miRNA靶向转录本。结果共得到49180个miRNA-靶基因对，包括17846个靶基因，这些基因被331个miRNA靶向（表S7）。个中，期望值≤5，期望值越低，靶向关系越好的靶基因有163、141、270、488、863、1315、2770、6033、10、10705、29、13702、77和12641个，期望值分别为0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、3.75、4.00、4.25、4.50、4.75和5.00（表S7）。此外，这些靶标紧张是转录因子、植物激素旗子暗记转导蛋白和植物与病原体相互浸染蛋白。
表2.冬凌草降解测序数据汇总。
研究者还利用降解组测序来鉴定miRNA靶标。测序后，共得到30858869个原始读数和7097001个唯一原始读数（表2）。干净的读数被映射到冬凌草转录组数据库的参考数据库（NCBI Sequence Read Archive：PRJNA910296）。在43115个输入转录本中，共确定了25672131个映射读数（83.19%）和34634个覆盖转录本（80.33%）（表2）。利用Cleave Landv3.0.1管道预测后，3066个靶标基因中的3066个裂解位点与228个（65.5%）miRNA干系，包括33个新的miRNA（240个靶标基因）和195个已知的miRNA（2826个靶标基因）（表S8）。先前的研究表明，一个miRNA可以靶向多个靶基因，同样，一个靶基因也可以被多个miRNA靶向。在本研究中，mtr-miR172c-5p_R-3预测的靶基因数量最多，确定了94个靶基因，其次是mtr-MIR396b-p5_2ss18AT19CT（91个靶基因）和mtr-MIR2603-p3_2ss9AC17AC（78个靶基因）。在新型miRNA中，PC-3p-14_301914的靶基因数最多，有33个靶基因，其次是PC-5p-141047_35（23个靶基因）和PC-5p-137561_36（23个靶基因）。研究者绘制了检测到靶基因数量最多的前25个miRNA（图S1）。此外，在降解组p值小于0.05的情形下，在裂解位点预测出了156个特定的miRNA-mRNA对（表S8）。为了确定裂解位点，根据mRNA位置上的峰高将降解组峰分为五类，并评估0类或1类中最主要的靶标基因。在降解构成果中，第0类创造了111个靶基因，个中大部分与转录因子有关，如SPL、ARF和NAC，被miR156、miR858、miR167和miR164家族裂解（表S8）。第1类，共有14个基因被13个miRNAs（包括miR482、miR6454和PC-3p-14_301914家族）裂解。在第2类中，创造了四种紧张与植物激素旗子暗记转导干系的mRNA，如SPL12、TIR1、SCL6和AFB2。这些靶基因分别被sslmiR156_R-1、stu-miR393-5p_L+1R-1、gma-miR171k-3p和mtrmiR393a_L+1R-4裂解（表S8）。别的7个靶标基因属于第3类，包括同源染色体-亮氨酸拉链蛋白、泛素蛋白连接酶和成长调节因子，分别被miR166a-3p_L+2R-2、MIR2603-p3_2ss9AC17AC和miR396a-5p_L+3_1ss24GA裂解。
5 GO富集和KEGG路子剖析
为了更好地理解miRNAs的功能，研究者利用GO数据库对冬凌草中所有miRNAs的靶标进行了GO富集剖析。降解组数据中共有2308个基因被2549个GO_术语富集，分为1388个生物过程、808个分子功能和353个细胞组分（表S9）。在生物过程方面，靶标数最高的前四个术语分别是生物过程（biological_process，247）、转录调控（regulation of transcription，DNA-templated，228）、转录（transcription，DNA-templated，199）和防御反应（defense response，98）。在分子功能方面，蛋白质结合（339）、分子功能（208）、ATP结合（204）和DNA结合（201）是最多的种别。常见的细胞身分术语有细胞核（752）、细胞质（392）、质膜（343）和叶绿体（297）（图4A，表S9）。在p值小于0.05的情形下，共鉴定出231个显著富集的GO_术语，个中包括141个生物过程、59个分子功能和29个细胞身分。图4B中突出显示了20个最富集的GO术语（表S9）。此外，还对51个差异显著的miRNA的靶基因进行了GO富集剖析。个中，45个显著差异miRNAs共鉴定出564个靶基因，564个靶基因富集了1116个GO_术语。靶标基因数量最多的前四个术语是生物过程类中的转录调控、DNA-模板（57）、转录、DNA-模板（53）、生物过程（46）和氧化还原过程（20）；细胞组分种别中的细胞核（168）、细胞质（88）、叶绿体（85）和质膜（73）；分子功能种别中的蛋白质结合（76）、DNA结合转录因子活性（57）、DNA结合（52）和ATP结合（45）（表S10）。
图4.降解组数据的GO富集剖析。(A）GO富集度最高的直方图剖析。(B)P值小于0.05的前20个GO富集的散点图剖析。
研究者利用KEGG（京都基因和基因组百科全书）进行了通路注释剖析。降解组数据中共有956个基因被注释到128个KEGG通路中，并被分为6类，包括生物系统（113个基因）、新陈代谢（581个基因）、遗传信息处理（307个基因）、环境信息处理（97个基因）、细胞过程（67个基因）和其他（55个基因）（图5）。基因数量最多的KEGG通路是植物-病原体相互浸染（101个基因）、植物激素旗子暗记转导（73个基因）和RNA运输（48个基因）（表S10）。此外，还创造了15个P值小于0.05的KEGG通路，包括植物激素旗子暗记转导（73个）、剪接体（46个）和丙酸代谢（12个）（表S11）。图5B列出了20条最富集的KEGG通路（表S10）。此外，45个差异显著的miRNA所靶向的564个靶标基因被注释到97个KEGG通路中。数量最多的前6个KEGG通路分别是植物激素旗子暗记转导（21）、内质网蛋白质加工（16）、RNA转运（14）、剪接体（13）、淀粉和蔗糖代谢（12）以及植物病原体相互浸染（11）（表S10）。
图5.降解组数据的KEGG富集剖析。(A)KEGG通路分类的直方图剖析。(B)基于P值的前20个KEGG通路富集的散点图剖析。
在这些通路中，萜类化合物代谢有16个靶基因，包括萜类化合物骨架的生物合成（7）、泛醌和其他萜类化合物-醌的生物合成（6）、倍半萜类和三萜类化合物的生物合成（2）、单萜类化合物的生物合成（1）。这些基因被多个miRNAs靶向，包括miR397、MIR5368、MIR828b、MIR393b、MIR7808、MIR12112、MIR5638a、miR167、miR172c、miR396a、miR172c、miR399d和PC-3p-5275_738（表S8）。此外，植物激素旗子暗记转导通路（ko04075）由73个靶基因代表，包含可被MeJA处理勾引的茉莉酸、脱落酸、成长素、乙烯和黄铜类固醇干系旗子暗记转导基因。这些基因包括赞助因子反应因子（ARF）、赞助因子反应蛋白（IAA）、AUXIN SIGNALING F-BOX（AFB）和磷酸酶2C（PP2C），受61个miRNAs（包括miR160、miR393、miR167和miR156）调控（图6，表S11）。例如，在茉莉酸合成路子中，茉莉酸ZIM构造域（JAZ）、茉莉酸-氨基合成酶JAR1和转录因子MYC2基因被富集，这些基因被MIR408、miR172c、MIR2603、miR393、miR394a、MIR7808和PC-5p-969_3165靶向（图6）。
图6.植物激素旗子暗记转导路子与干系miRNA。
6 miRNA表达的qPCR验证
qPCR剖析是为了验证从小规模RNA测序中得到的miRNA的表达模式。研究者随机选取了12个miRNA，包括4个新型miRNA和5个已知miRNA，通过qPCR对所有4个样本进行验证。与高通量测序比较，大多数样本的qPCR剖析都不雅观察到了类似的miRNA表达趋势（上调或下调）（图7）。
图7.通过qRT-PCR验证随机选择的部分已知和新型miRNA的相对表达水平。以U6 sRNA为内参进行了定量实时PCR；JY0h处理中的表达量设为1（四重复的均匀值±SD）。
7 多组学剖析：MeJA调控和基因型依赖的miRNA-mRNA模块
研究者结合多种组学方法，包括小RNA、转录组和降解组测序进行剖析，确定了MeJA调控的miRNA-mRNA对（JY_M3h vs JY_M0h，LS_M3h vs LS_M0h）（图8，表S13）。在JY_M3h vs LS_M0h比较组中，有10个miRNA-mRNA对，包括4个显著不同的miRNA（mes-miR394a_L+1_1ss16AG、ptc-miR167f-3p_L-1、mdm-MIR156wp3_2ss10TA21TC和mdm-MIR10987-p3_2ss2TC18GT）靶向10个显著不同的靶基因，并鉴定出4个具有拮抗调控模式的miRNA-mRNA对（图8A）。在LS_M3h vs LS_M0h比拟组中，有17对miRNA-mRNA，包括7个显著不同的miRNA（PC-5p-141047_35、stu-MIR391-p3_2ss17GT18CT、stu-miR482a-3p_1ss8TC、sly-miR167b-3p_R-3_1ss10AG、mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC、gma-miR394a-5p和PC-3p-23343_211）靶向17个明显不同的靶基因，6个miRNA-mRNA对表现出拮抗调控模式（图8B）。此外，结合JA生物合成路子（图6），还创造了9个靶向18个mRNA的miRNA与MeJA反应有关，个中包括靶向JAR1的csi-MIR393b-p3_1ss10TC和rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA；PC-5p-969_3165targetingJAZ；mtr-MIR408-p3_2ss18GT19GA,mtr-miR172c-5p_R-3,mtr-MIR2603-p3_2ss9AC17AC,aly-miR393a-5p,gma-miR393a_L+1和gma-miR394a-5ptargetingMYC2.总之，推测有36对miRNA-mRNA参与了MeJA的调控（图8，表S13）。
此外，基因型依赖的miRNA-mRNA对（JY_M0hvs.LS_M0h，JY_M3hvs.LS_M3h）也被鉴定出来（图8，表S14）。在JY_M0h vs LS_M0h比较组中，有22对miRNA-mRNA，包括14个显著不同的miRNA（如csi-miR156g-3p、PC-3p-40287_130、ssl-miR166a_L+2R-2和mtr-miR159a_R-2）靶向22个显著不同的靶基因，以及11对具有拮抗调控模式的miRNA-mRNA（图8C）。在JY_M3h vs LS_M3h比拟组中，有18对miRNA-mRNA，包括12个明显不同的miRNA（如gma-miR160a-3p、PC-3p-4_1276478、mdm-MIR156w-p3_2ss10TA21TC和ptc-miR167f-3p_L-1）靶向17个明显不同的靶基因，有6对miRNA-mRNA表现出拮抗调控模式（图8D）。终极，有36对miRNA-mRNA被推测参与了基因型依赖性反应（图8，表S14）。
图8.多组学剖析MeJA调控的miRNA-mRNA模块的显著差异和基因型依赖性。A.JY_M3h vs JY_M0h，B.LS_M3h vs LS_M0h，C.JY_M0h vs LS_M0h，D.JY_M3h vs LS_M3h。
8 参与冬凌草甲素合成的miRNA-mRNA模块
为了预测与冬凌草甲素生物合成干系的miRNA和靶基因，研究者对降解组测序进行了研究，以确定靶向冬凌草甲素生物合成基因的miRNA。结果创造，共有7个miRNA靶向了6个与冬凌草甲素生物合成干系的基因（表3）。个中，mtr-miR397-5p_R-1、gma-MIR5368-p3_1ss2GA、mtr-miR172c-5p、stu-miR167d-3p_2ss12TA19CT、ptc-MIR828b-p5_2ss9CG19TA、csi-MIR393b-p3_1ss10TC、rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA和smiMIR12112-p3_2ss17GT18GT分别以HDS、ICMT、AACT、DXS、FPS、FPS、IspH和HMGR为靶标（表3）。此外，除了rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA（仅在JY_M3h组中表达）外，对这6个miRNA-mRNA表达模块进行了剖析（图9）。从图9可以看出，miRNA和靶标基因的表达大多呈现相反的表达模式，这与miRNA切割目的基因的征象同等。
此外，研究者还利用psRNA Target做事器，基于冬凌草甲素生物合成基因和所有miRNA预测了与冬凌草甲素生物合成干系的miRNA。结果创造，共有151个miRNA被预测为51个与冬凌草甲素生物合成干系的基因的靶标（图10，表S15）。个中，一个靶标基因可被多个miRNA靶向，如TRINITY_DN13455_c0_g1(GGPS)可被20个miRNA靶向，TRINITY_DN18593_c0_g1(FPS)可被18个miRNA靶向，TRINITY_DN12712_c0_g1(IPP)可被15个miRNA靶向。同样，一个miRNA可以靶向多个靶标基因，如aly-MIR408-p5_2ss13TA18CT靶向14个基因，ptc-MIR167b-p3_2ss13AG17AG靶向12个基因、mdm-MIR169g-p3_2ss16CT18GC和mes-MIR171lp5_2ss15CT17AT靶向10个基因，gma-miR156b_L+1R-1_1ss20AC靶向8个基因。由此推测，miR408、miR167、miR169、miR171和miR156可能在冬凌草甲素的生物合成过程中起着重要的调控浸染。此外，有24个新的miRNAs被预测为靶向冬凌草甲素生物合成的干系基因，包括PC-5p-791607_4、PC-5p-141047_35、PC-3p-326069_12、PC-5p-175906_26、PC-3p-929800_3和PC-3p-256709_16（表S13）。结合降解测序的结果，mtr-miR397-5p_R-1 TRINITY_DN12513_c0_g1（HDS），mtr-miR172c-5p TRINITY_DN18321_c0_g2（AACT），stu-miR167d-3p_2ss12TA19CT TRINITY_DN18459_c0_g2（DXS），ptc-MIR828b-p5_2ss9CG19TA TRINITY_DN18593_c0_g1（FPS）模块在降解组测序和psRNATarget中都检测到了，表明这些miRNAs参与了冬凌草甲素生物合成的调控。
表3.通过降解测序预测靶向冬凌草甲素生物合成干系基因的miRNAs。
图9.通过降解组测序预测参与冬凌草甲素生物合成的miRNA-mRNA Modules的表达模式。miRNA和mRNA的表达数据来自测序。在JY_M0h中的表达被设为1（四重复的均匀值±SD）。
图10.根据psRNATarget预测的与冬凌草甲素生物合成路子干系的miRNA及其靶标之间的关系。大多数miRNA靶标当选中映射到这一路子中，但期望值较低。
9 miRNA-mRNA模块表达的qPCR验证
为了验证miRNA-mRNA模块结果的可靠性，研究者进行了qPCR剖析以确认miRNA-mRNA模块的表达模式（图11）。研究职员随机选择了8个miRNA-mRNA模块，包括一些与冬凌草甲素生物合成干系的模块对，在JY株系或LS株系中进行qPCR验证。不同miRNA-mRNA模块的表杀青果与深度测序数据相称，而且miRNA和靶基因的表达呈现相反的调控趋势，这与miRNA和靶基因的调控浸染同等。这些结果表明qPCR和高通量测序的结果是同等的。
图11.miRNA-mRNA模块的qRT-PCR验证。直方图显示qRT-PCR验证miRNA-mRNA模块的结果，折线图显示miRNA-mRNA模块的序列结果。所有数据将对照组JY_M0h或LS_M0h归一为1。
谈论
microRNA是一种非编码RNA小分子，长度为18-25nt，是转录后的基因调控因子。这些miRNA通过与特定的靶标mRNA相互浸染，与植物的成长和发育、植物形态发生、细胞分解以及各种生物和非生物胁迫有关。最近，越来越多的研究表明，miRNAs参与了植物次生代谢产物的调控，如miR5072、miR858、miR156和miR360。利用多种组学方法，如小RNA深度测序和降解组，在芍药、马铃薯和Picrorhiza kurroa中创造了一些植物次生代谢产物相应的miRNA。然而，还没有关于冬凌草中miRNAs的鉴定和表达剖析的研究。在本研究中，研究者采取了多组学技能，将小RNA、转录组和降解组联系起来，利用深度测序技能系统地研究了冬凌草中的miRNAs，包括MeJA处理的影响。本研究稽核了两种不同的冬凌草基因型中的miRNAs和对冬凌草甲素生物合成调控的miRNAs，这些基因型的冬凌草甲素水平不同。研究者的研究共创造了348个miRNA，包括287个已知miRNA和61个新型miRNA。个中，51个miRNA在不同样本中有显著表达，27个miRNA对MeJA有反应。总之，本研究首次利用小RNA高通量测序技能鉴定了冬凌草中的miRNAs，为研究miRNAs对冬凌草成长发育和次生代谢物生物合成的调控奠定了根本。
1 miRNA-mRNA模块在冬凌草中具有多种生物学功能
研究者进行了降解组测序，以确定miRNA的靶标。在本研究中，研究者创造了与228个miRNA干系的3066个靶基因。个中，许多靶基因是转录因子，包括GRF、AP2/ERF、HD-Zip、MYB、SPL、DOF、NAC和ARF。这些miRNA-mRNA调节模块包括mtr-miR396b-5p_1ss21GA-GRF9、mtr-miR172b-RAP2-7、aqcMIR396b-p3_1ss9AT-ATHB-15、ly-miR166a-3p_L+2R-2-REVOLUTA、ath-miR858a_L-1R+1-MYB114,mtr-miR159a-MYB80,csi-miR159a-3p_R+3-MYB4,ssl-miR156_R-1-SPL6,mtr-miR156b-5p_L+1-SPL5,stu-MIR408b-p3_1ss1AT-DOF5.4、csi-miR164a-5p-NAC和gmaMIR5368-p3_1ss2GA-ARF5。大量研究表明，转录因子对植物的成长发育、激素旗子暗记转导、困境胁迫和次生代谢产物的生物合成具有主要的调控浸染。GRF9作为一种成长调节因子，在调节植物成长、发育和胁迫方面发挥着重要浸染。在拟南芥中，miR396紧张通过调节GRF3来影响根的成长。在水稻中，miR396可通过靶向GRF来调控水稻对褐飞虱反应的分子机制。RAP2-7属于AP2/ERF转录因子家族。研究表明，AP2/ERF转录因子广泛调控植物的成长和发育，以应对植物胁迫。在大连蓟马中，miR172-AP2可调控花的发育。在大豆中，miRNA172c的过表达或GmNNC1的表达不敷可提高大豆的耐盐性。在水稻中，研究创造光色素负调控miR172d可抑制AP2家族中OsIDS1和SNB的表达，从而勾引着花。ATHB-15和REVOLUTA属于HD-Zip转录因子家族。在番茄中，sly-miR166a及其靶基因HD-ZipIII都会对黄叶卷曲病毒传染做出反应，并且它们的表达是对立的。此外，AtSPL9通过激活miR172降落下贱类似AP2的着花抑制基因的表达水平，产生miR156-SPL9-miR172-AP2调控模块，促进了大连蓟马的着花。同样，miR156可通过负向调节转录因子SPL9来调节花青素合成基因DRF的表达，并负向调节连花生中花青素的合成。总之，这些结果表明，冬凌草的miRNA-mRNA模块在上述过程中发挥了主要浸染。
2 参与冬凌草植物激素旗子暗记通路的miRNA-mRNA模块
植物激素对植物成长发育、胁迫反应和次生代谢物的生物合成所涉及的旗子暗记网络至关主要。特殊是，外源施用MeJA可增加或减少各种植物中次生代谢物的积累。在人参中，MeJA增加了人参皂苷和酚类化合物的积累。在铁皮石斛中，MeJA处理可提高芳香化合物的含量。此外，研究表明，MeJA能勾引与次生代谢物合成路子有关的酶的表达。例如，MeJA能显著上调灵芝中HMGR的表达。在罗汉果中，包括SgHMGR、SgSQS、SgCS和SgCYP450在内的罗汉果甙生物合成路子基因都会因MeJA处理而上调。同样，MeJA处理会增加冬凌草中冬凌草甲素次生代谢产物的含量。因此，本研究对MeJA处理后的miRNA水平进行检测，将有助于创造更多与冬凌草甲素合成有关的调控miRNA。以往的研究表明，不同的miRNA在不同的生物过程中调控植物激素干系基因的表达。在本研究中，植物激素旗子暗记转导路子（ko04075）由61个miRNAs（包括miR160、miR393、miR167和miR156）靶向的73个靶基因所代表，包含了可通过MeJA处理勾引的茉莉酸、脱落酸、成长素、乙烯和油菜素类脂干系旗子暗记转导基因。在茉莉酸旗子暗记通路中，茉莉酸抗性1（JAR1）、茉莉酸ZIM构造域（JAZ）和茉莉酸不敏感1（JIN1，或MYC2）蛋白是对MeJA起反应的三个关键受体蛋白。csiMIR393b-p3_1ss10TC和rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA是JAR1蛋白的靶标，通过MeJA处理，它们在冬凌草的JY和LS基因型中的表达量都有所增加。在其他物种中，JAR1可能是不同miRNA的靶标。在番茄中，JAR1蛋白在脱水胁迫下被slymiR827-5p靶向。JAZ蛋白被PC-5p-969_3165靶向，通过MeJA处理，PC-5p-969_3165在冬凌草的JY和LS基因型中的表达也增加了（图6，表S11）。在番茄中，sly-miR169a-5p以JAZ受体为靶标，在干旱处理后的所有组织中的表达量都会低落。JIN1又称MYC2，有6个miRNA的靶标，包括mtrMIR408-p3_2ss18GT19GA、mtr-miR172c-5p_R-3、mtr-MIR2603-p3_2ss9AC17AC、ly-miR393a-5p、gma-miR393a_L+1和gmamiR394a-5p。在鹰嘴豆中，miR408以铜干系基由于靶标，可能会提高耐旱性。在芥菜中，bramiR172b-3p在ATCCS中受到负调控，是一种潜在的Cd2+特异性抗性因子。miR393通过抗性TIR1基因（mTIR1）增强拟南芥的耐盐性。先前的研究表明，miR394以F-box为靶标，在植物成长和发育过程中对胁迫起着重要浸染。在水稻中，miR394以编码F-box蛋白的LEAFINCLINATION4（LC4）为靶标，在调节叶片倾斜方面发挥主要浸染。总之，在JA旗子暗记通路中，miRNA及其干系基因在植物的成长、发育和胁迫中起着关键浸染。结合MeJA对次生代谢产物合成的调控，可以推测与JA干系的miRNA及其干系基因调控了冬凌草甲素的合成。此外，不同激素之间也存在相互浸染。例如，茉莉酸（JA）在抗病过程中常日与赤霉素（GA）相互浸染，在植物成长发育和对非生物胁迫的相应过程中与ABA相互浸染。在本研究中，涉及茉莉酸、脱落酸、成长素、乙烯和油菜素类脂干系旗子暗记基因的成长素相应因子（ARF）、成长素相应蛋白（IAA）、AUXINSIGNALINGF-BOX（AFB）、磷酸酶2C（PP2C）、EINs、DELLA和BZR基因也对MeJA处理有反应。据推测，这些基因可能直接或间接参与调控冬凌草甲素的合成。
3 参与冬凌草中冬凌草甲素生物合成的miRNA-mRNA模块
miRNA在植物次生代谢物的生物合成过程中发挥着重要浸染。特殊是在药用植物中，次生代谢物紧张是有效身分，是治疗效果的根本。目前，已从药用植物中鉴定出多种对次级代谢生物合成具有调控功能的miRNA，包括miR160、miR156、miR5021和miR4995。冬凌草甲素是冬凌草的紧张活性身分，属于二萜类化合物，由于其良好的生物活性和较高的药用代价，已被广泛研究。过去，对冬凌草甲素生物合成的研究紧张集中在催化酶上。研究miRNA介导的冬凌草甲素生物合成有助于完善冬凌草甲素生物合成调控网络的构建。在本研究中，参与MVA和MEP路子中萜类化合物合成路子上游部分的基因，如AACT、HMGR、DXS、HDS、IspH、FPS和ICMT基因，以及一些中游和下贱基因、选择了CPS4、CPS5、KSL5、IrCYP706V2和IrCYP706V7等中下贱基因作为鉴定miRNA的靶标基因，并认为这些miRNA参与了冬凌草甲素的生物合成。通过降解组测序，只检测到7个miRNA-mRNA模块，包括7个靶向6个冬凌草甲素生物合成干系基因的miRNA，包括靶向HDS的mtr-miR397-5p_R-1、靶向AACT的mtrmiR172c-5p、靶向HDS的mtrmiR172c-5p、靶向HDS的mtrmiR172c-5p、靶向AACT的mtrmiR172c-5p、stu-miR167d-3p_2ss12TA19CT靶向DXS，ptc-MIR828b-p5_2ss9CG19TA和csi-MIR393b-p3_1ss10TC靶向不同剪接位点的FPS，rgl-MIR7808-p5_2ss2GA17GA靶向IspH，smi-MIR12112-p3_2ss17GT18GT靶向HMGR。此外，有151个miRNAs靶向了51个基因，这些基因通过psRNATarget被确定与冬凌草甲素的生物合成有关。结合被miRNAs靶向的靶基因数量，研究者推测miR408、miR167、miR169、miR171和miR156可能在调控冬凌草甲素的生物合成过程中发挥了特定的调控浸染。结合之前的研究报告，本研究的创造显示了冬凌草与其他物种的异同。例如，S.miltiorrhiza中以AACT为靶标的miR5027；银杏叶中以AACT为靶标的miR167和以HMGR为靶标的miR457；A.annua中以FPS和HMGR为靶标的miR414。终极，miRNA对次生代谢产物的调控在不同物种间存在细微差别。有必要进一步探索与桔梗合成干系的调控miRNA，这将为深入剖析桔梗合成路子奠定主要根本。
结论
本研究共鉴定了348个miRNAs，包括287个已知的miRNAs和61个新的miRNAs。个中，51个miRNA在不同组中有显著表达，27个miRNA对MeJA有反应。通过降解组测序，共鉴定出与228个miRNA干系的3066个靶基因；个中，降解组数据中的2308个基因被富集到2549个GO_Terms中，降解组数据中的956个基因被注释到128个KEGG通路中。miR397、miR172、miR167和MIR828参与了冬凌草甲素生物合成的调控，其他miRNA如miR408、miR169、miR171和miR156在冬凌草甲素生物合成调控中的浸染有待进一步验证。此外，还创造了miR156、miR167、miR393、miR396、miR482和PC-3p-19822_242的靶向调控植物激素旗子暗记转导路子。总之，本研究了冬凌草中的miRNA，为miRNA介导的冬凌草成长发育和次生代谢产物生物合成的调控分子机制供应了依据。
