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WB留心这些问题新手也能做出知足结果_卵白_卵白质

落叶飘零 2025-01-21 08:08:07 0

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Western Bolt实用小细节

Western blot(WB)是检测蛋白质及蛋白质翻译后润色的经典方法,可在大略或繁芜的生物样品中供应有关靶蛋白的半定量或定量数据。
WB步骤繁芜,常日包括:

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蛋白样本制备→电泳→转膜→封闭→孵育一抗→孵育二抗→显影→剖析。

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(图片来自网络侵删)

WB任何过程涌现Bug均可影响结果的重复性与灵敏度,因此必须把稳将WB的每个步骤标准化。
本日给大家分享WB各个过程中须要把稳的细节!

1

样品制备

有效的样品制备是影响WB可重复性的非常主要的成分。
需考虑以下问题:

1、靶蛋白是可溶/不可溶蛋白,细胞质/膜蛋白?2、溶解的蛋白或其翻译后润色的坚持是否须要添加额外的缓冲身分(例如洗涤剂、酶抑制剂)?

3、蛋白质定量的方法是什么,缓冲身分会滋扰蛋白定量吗?

BCA蛋白定量检测法是总蛋白质定量的常用方法,其蛋白间差异较考马斯染料法的更小,但与还原剂、螯合剂不兼容(兼容去垢剂)。

2

电泳

1、最得当的凝胶浓度是什么?不同分子量的蛋白分离胶浓度对应表:

2、哪种电泳缓冲液最得当?

例如,3-(N-吗啡啉)丙磺酸缓冲液(MOPS缓冲液)适宜~75KDa的蛋白质,2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)适宜<36KDa的蛋白质。

3、电泳多永劫光和以及电泳条件?

4、蛋白质的分子量迁移情形如何?蛋白质的分子量迁移因凝胶类型、浓度和电泳缓冲液的不同而不同。
对应情形如下:

3

转膜

1、什么是最得当的膜?例如,PVDF膜或NC膜(0.45μm)。
PVDF膜有两种规格,0.45μm的膜适用于检测大于20KDa的蛋白质,0.2μm膜适用于小于20的蛋白质。
PVDF须要在甲醇中浸泡1-2min激活。

不同分子量蛋白转膜条件:

大于150KDa蛋白可恒压20V 4度湿转过夜。

2、转膜液甲醇浓度如何?

小分子量蛋白的转膜须要把稳:(1)高浓度的凝胶有利于小分子量蛋白的分离。
一样平常在目的蛋白离凝胶前沿0.5-1cm时停滞电泳,太靠近凝胶前沿易引起边缘效应。

(2)SDS阻挡蛋白与膜的结合,小蛋白更是如此。
因此电转液中可以不加SDS。

(3)保持甲醇浓度20%。

大分子量蛋白的转膜须要把稳:

(1) 而甲醇易使SDS从蛋白上分开,因此适当降落甲醇浓度至10%或更低,防止蛋白沉淀。

(2) 降落电转液中甲醇的含量,这样可以促进凝胶的膨胀,更易于大分子量蛋白的转出。

(3) 利用硝酸纤维素膜时,甲醇是必需的。
如果是PVDF膜,甲醇可以不必加入电转液,但须要预先用甲醇活化。

3、是否应进行膜染色以评估转膜效率?

丽春红染色可在膜上瞥见清晰、连续的粉赤色条带,无白色圈圈涌现。
转膜不佳时,条带色淡、有气泡,乃至无条带。

4

封闭

封闭液中可与固相载体表面的空缺位置结合,同样以机器补充(堆积)和吸附覆盖的办法结合在膜上。

1、何种封闭液最得当(例如BSA或脱脂牛奶)?

脱脂奶粉身分繁芜(多种蛋白质的稠浊物),磷酸化抗体可能会导致背景增加,此外,由于自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。
BSA也是非常常用的封闭液,但BSA可能含有IgG或其他血清蛋白等污染,这些蛋白可以与某些抗体产生交叉反应,增加非特异性旗子暗记

但需把稳,过度封闭也会导致靶蛋白的旗子暗记强度变弱。
研究者创造有些抗体在室温下孵育2-4小时会产生比在4℃温育过夜时更强的旗子暗记。

2、封闭液该当利用什么浓度(例如,2.5%)和什么缓冲液(例如,TBST)?

5

孵育一抗

1、一抗的一样平常特色是什么(例如单克隆兔IgG)?2、一抗对天然蛋白或变性蛋白特异吗?识别表位序列/区域是否已知?3、一抗是否存在已知的其他条带?

蛋白质分子量不对时蛋白质可能存在降解,翻译后润色,如糖基化、磷酸化、前体蛋白剪切等。

4、是否设置了适当的对照以确定抗体的特异性?

利用阳性和阴性对照可以随意马虎地确定抗体的特异性。
最好的阳性对照是过表达目标蛋白的纯化蛋白质或裂解物,而最好的阴性对照是来自敲除动物组织的组织或细胞裂解物。

如果无法得到过表达目标蛋白的纯化蛋白或裂解物,许多公司如Aviva Systems Biology,Cell SignalingTechnology和Santa Cruz Biotechnology都可以得到许多组织和细胞的裂解物,可用作阳性对照(已知靶蛋白在这些组织或细胞中高度表达)。

6

孵育二抗

1、二抗是什么标记结合的(HRP或荧光)?2、二抗是否特异性针对一抗?3、是否存在可检测/过度曝光的旗子暗记,如果是,是否须要调度抗体浓度?

7

显影

1、采取什么显影方法(化学发光还是荧光)?2、显影干系试剂是否精确储存?3、膜是否可以剥离抗体进行重新检测?哪种抗体剥离缓冲液最适宜我的实验?

8

剖析

1、目的条带是否在检测系统的线性范围内?2、哪种量化方法最适宜(全泳道或剖析单独目的条带)?

3、归一化方法是什么?

利用内参蛋白是归一化的常用方法,其条件是假定内参蛋白在实验条件下保持稳定。
内参蛋白与目的蛋白与分子量需至少相差5KDa以上。
常用内参抗体分子量及定位:

IGF-1处理C2C12细胞检测eEF2水平,创造不同内参蛋白对处理存在变异性:

4、如何精确的呈现WB图片?

常日WB数据以代表性图像的形式呈现,以反应干预的效果和WB的质量。
这就存在呈现图像时的伦理问题,论文中的WB图像须要准确呈现量化数据的结果。
WB图片呈现是学术不真个重灾区,例如来自多个WB的图像的拼接以形成一个连续的图像可能会模糊样本之间的变革的大小:

此外过饱和的WB会导致感兴趣的条带之间没有明显的差异:

调度比拟度以遮蔽杂带(c)、图像处理以增强、减少或移除条带(d)也是不被许可的:

已揭橥SCI论文WB条带存在问题举例:

9

替代WB的新兴方法

一种常见的WB替代方法是利用免疫酶联吸附反应(ELISA)来定量目标蛋白(总蛋白或磷酸蛋白)的丰度。

比较WB而言ELISA的上风有:样本容量大(例如96孔板)、灵敏度高、可绝对定量(利用标准品)、耗时短(2-4小时)等。
当然ELISA也存在一些问题,例如不同分子量的蛋白质无法相互区分、利用的一抗可能产生虚假高旗子暗记、不能进行重新检测等。

另一项新兴的技能是利用蛋白质芯片来检测单个样本中多个目标蛋白质的存在,乃至DNA和RNA的潜在蛋白质相互浸染,并可丈量酶的活性。
此外,用于蛋白质剖析和极其精确定量的质谱(即LC-MS/MS)的利用正变得越来越广泛。

质谱比ELISA和传统的WB技能都具有明显的上风,在高灵敏度和宽动态范围(0.5-500 ng/μl)下可以区分多种蛋白质亚型。
然而质谱剖析须要高度专业化、昂贵的设备和技能,在实验室中利用也越来越常见。

质谱可与WB联用来确认抗体特异性、确定IP后新的蛋白质-蛋白质相互浸染、以及创造翻译后润色等。

10

WB疑难解析

本日给大家分享WB把稳事变就到此为止了,希望对大家有所帮助,祝大家统统顺利!

参考文献

MishraM, Tiwari S, Gomes AV. Protein purification and analysis: next generationWestern blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 2017;14(11):1037-1053.

BassJJ, Wilkinson DJ, Rankin D, et al. An overview of technical considerations forWestern blotting applications to physiological research. Scand J Med SciSports. 2017;27(1):4-25.

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