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导读
花青素是一类主要的次生代谢产物，决定了菊花（一种著名的切花）五颜六色的花瓣。“Arctic Queen”是一种白菊花品种，在着花阶段不会积累花青素。在着花后阶段，“Arctic Queen”的花瓣会积聚花青素并变成赤色。然而，这种花色变革背后的分子机制仍不清楚。本研究通过转录组剖析，鉴定出CmNAC25是促进“Arctic Queen”着花后阶段花青素积累的候选基因。CmNAC25直接与CmMYB6的启动子结合，CmMYB6是促进菊花青素生物合成的MBW蛋白复合物的核心成员，以激活其表达。CmNAC25还直接激活CmDFR的启动子，CmDFR编码花青素生物合成中的关键酶。CmNAC25在着花后阶段高表达，而CmMYB#7（一种已知的R3 MYB转录因子）的表达水平显著降落，该转录因子滋扰了CmMYB6-CmbHLH2复合物的形成。菊花和烟草（Nicotiana tabacum）的遗传转化证明，CmNAC25是花青素生物合成的正调节因子。其余两个在着花后阶段变红的品种也表现出类似的机制。综上所述，CmNAC25通过直接激活CmMYB6和CmDFR，在着花后阶段正向调控菊花花瓣中花青素的生物合成。本研究结果揭示了CmNAC25在调控花瓣朽迈过程中花色变革的关键浸染，为菊花花色的分子设计育种供应了靶基因。
论文ID
原名：CmNAC25 targets CmMYB6 to positively regulate anthocyanin biosynthesis during the post-flowering stage in chrysanthemum
译名：CmNAC25靶向CmMYB6正向调控菊花着花后阶段花青素的生物合成
期刊：BMC Biology
IF：5.4
揭橥韶光：2023年10月
通讯作者：陈发棣
通讯作者单位：南京农业大学
DOI号：10.1186/s12915-023-01719-7
实验设计
结果
1 菊花“Arctic Queen”的花色在花后阶段由于花瓣中花青素的积累而变红
本研究利用了切花品种“Arctic Queen”（图1）。为了剖析菊花花瓣在着花后阶段的颜色变革，研究者将花序完备开放后的着花过程分为S1（全花期）、S2（盛花后10 d）和S3（盛花后20 d）3个阶段（图1A）。如图1A所示，最外层射线小花的花瓣颜色在S1处为白色，在S2处变为浅赤色，在S3处变为更红。花瓣颜色的CIELab剖析显示，花瓣的a（红度）和C（色度）值逐渐增加，而L（亮度）和b（黄蓝色）值从S1到S3逐渐降落（图1B）。色素定量剖析表明，S1处花瓣未检测到花青素，S2-S3花瓣中花青素含量增加，与表型同等（图1C、D）。这些结果表明，由于花青素的积累，“Arctic Queen”花瓣的品种在着花后阶段逐渐变红。
图1.菊花“Arctic Queen”花瓣中的花青素积累在着花后阶段勾引花色。比例尺= 1cm。A 花后阶段花色的变革。S1（白色），S2（略带赤色），S3（明显赤色）。B CIELab花瓣在3个着花期的颜色参数。偏差线表示五个生物学重复的SD。C 从三个花期的花瓣中提取花青素。D 3个花期花瓣中总花青素含量（TA）。偏差线表示三个生物学重复的 SD。B和D中的不同小写字母表示差异显著（p＜0.05，方差剖析，Tukey校正）。
2 菊花花瓣3个花期的转录组学剖析
研究者从S1、S2和S3阶段采样的“Arctic Queen”最外层射线小花中提取的总RNA进行为RNA-Seq剖析。共得到9个样品（三个阶段中每个阶段进行3次生物学重复）。组装过程的结果是一组139,504个单基因序列，均匀长度为1138 bp，N50为1773 bp，GC含量为39.09%（表S1）。
研究者通过对不同着花期（S1、S2和S3）的转录组进行成比拟较，剖析了差异表达基因（DEG）（图2）。有4955个基因在S2中的表达明显高于S1，3721个基因在S3中的表达高于S2。然而，有5058个基因在 S2 中的表达量明显低于 S1，6837 个基因在 S3 中的表达量低于 S2 中的表达量（图 2A）。在S1 vs S2和S2 vs S3的成比拟较中，共有2819个DEGs（图2B），个中483个和911个DEGs同时上调和下调（图2C，D）。
图2.不同阶段“Arctic Queen”花瓣转录组的DEG剖析。A S1 vs S2 和 S2 vs S3 中上调和下调的 DEG 数量。B S1 vs S2 和 S2 vs S3 中总 DEG 的韦恩图。C，D S1 vs S2 和 S2 vs S3 中上调和下调 DEG 的韦恩图。
3 花青素生物合成路子中的DEGs
为了探究花青素积累导致“Arctic Queen”花瓣在花后阶段着色的分子机制，研究者进一步剖析了与花青素生物合成干系的DEGs的表达谱（图3）。如图3A所示，在S1到S2期间，花青素生物合成路子中构造基因的嫡系同源物（包括CHS、CHI、F3H、F3'H、DFR、UF3GT、3MaT1和3MaT2）同时上调，与花瓣中花青素的积累干系（图1）。这一结果表明，潜在的上游转录因子可能在转录上调控花青素积累的多个构造基因。
因此，研究者鉴定了多个编码 MYB-like、bHLH 和 WD40 转录因子的 DEG。图3B显示了代表性MYBs、bHLHs和WD40s的表达谱。从S1到S2，MYBs的几个嫡系同源物上调表达，包括CL13157.Contig2_All，CL1880.Contig1_All，CL4147.Contig2_All，CL4673.Contig1_All，Unigene1242_All，Unigene18139_All和Unigene42407_All（图3B）。在图3B中bHLHs的嫡系同源物中，只有CL5776.Contig3_All上调，WD40（Unigene39656_All）的嫡系同源物上调。在这些基因中，CmMYB6（CL4673.Contig1_All同源物）和 CmbHLH2（CL5776.据宣布Contig3_All同系物）通过在菊花中形成复合物来促进花青素的生物合成。此外，与其他调控基因比较，CmMYB6上调具有较高的FPKM值（图3B），表明其在朽迈花瓣中花青素的积累中起着关键浸染。
花青素的生物合成受经典MBW复合物的调控。根据上述DEGs剖析，研究职员推测CmMYB6（CL4673.Contig1_All同源），CmbHLH2（CL5776.Contig3_All同源）和CmTTG1（Unigene39656_All同源）是MBW复合物的候选成员，在着花后阶段调节花色。因此，参考先前的研究，研究者进行了Y2H测定和BiFC测定以检测CmTTG1和CmMYB6/CmbHLH2之间的相互浸染。结果，CmTTG1 与 CmMYB6 和 CmbHLH2 相互浸染（图 S1A 和 B）。由于 CmMYB6 和 CmbHLH2 形成蛋白质复合物，这提出了一个问题，即 CmTTG1 是否肃清了 CmMYB6 和 CmbHLH2 之间的相互浸染。为此，按照Schwenk等的描述，研究者进行了Y3H测定（图S1C）。与CmMYB6和CmbHLH2共表达的酵母细胞可以在所选培养基上成长，但AD-T+BD-Lam组合不能成长。同时，添加CmTTG1对所选培养基上共表达CmMYB6和CmbHLH2的酵母细胞的成长没有影响（图S1C），表明CmTTG1不影响CmMYB6和CmbHLH2之间的相互浸染。因此，研究职员推断 CmMYB6、CmbHLH2 和 CmTTG1 在菊花中形成蛋白质复合物。
图3.“Arctic Queen”花瓣中花青素生物合成路子基因在3个花期的差异表达。A 菊花花秦素生物合成路子中构造基因的表达模式。B 编码 MYB-like、bHLH 和 WD40 转录因子的基因的差异表达。热图描述了归一化的基因表达值（log10[FPKM + 1]），个中FPKM值代表了三个生物学重复的均匀值。
4 酵母单杂交筛选和 CmNAC25 的分离
既往研究创造，由于CmMYB#7的表达变革，“Jimba”在自然栽培下偶尔会自发产生赤色的花瓣，即“ Turning red Jimba”。在本研究中，研究者着重于“Arctic Queen”在着花后阶段逐渐变成赤色的花瓣。研究者验证了CmMYB#7的表达，结果表明，CmMYB#7也参与了白菊花品种花后花瓣颜色变革的调控（图S2）。CmMYB#7在盛花期（S1）表达量较高，进入花后期（S2–S3）后显著低落（图S2），初步解释了花青素在花后阶段开始积累的缘故原由。然而，MBW蛋白复合物成员在花后阶段表达逐渐增加和花青素积累的分子机制有待进一步探索。
为了探究菊花花瓣花后花青素生物合成的上游调控机制，研究者利用菊花MBW复合体核心成员CmMYB6的启动子进行酵母单杂交（Y1H）筛选。从菊花基因组DNA等分离出1219 bp长的CmMYB6启动子，作为诱饵插入pHIS2载体中，筛选“Arctic Queen”花瓣的cDNA文库，并在转录组数据中通过原始细胞鉴定出几个阳性克隆（表S2）。在这些基因中，只有1个NAC转录因子（Unigene39896_All）在S1到S2期间上调表达，与CmMYB6和花青素积累的上调干系。因此，从“Arctic Queen”中克隆了该基因的全长cDNA序列，称为CmNAC25，以供进一步鉴定。扩增后，CmNAC25 的 ORF 为 921 bp，编码由 307 个氨基酸组成的蛋白质，预测分子量为 33.77 kDa，等电点（pI）为 5.10。
研究者进行了CmNAC25 的亚细胞定位剖析，将 35S::GFP-CmNAC25 和 35S::D53-RFP 构建体（细胞核标记物）瞬时共转化到本氏烟草叶片的表皮细胞中。空载体35S::GFP 和 35S::D53-RFP 构做作为对照。图4A显示，在细胞质和细胞核中均检测到对照的GFP旗子暗记，而仅在细胞核中检测到35S::GFP-CmNAC25的GFP旗子暗记。结果表明，CmNA25位于细胞核内。序列比对剖析表明，CmNAC25 在其 N 末端有一个守旧的 NAM 构造域（图 4B），这是 NAC （NAM/ATAF/CUC）转录因子家族中众所周知的特定构造域。研究者在酵母系统中进行CmNAC25的转录活性剖析，以pCL1的转化为阳性对照，空载体pGBKT7为阴性对照。酵母细胞在SD/-H/A培养基中的成长表明CmNAC25（CmNAC25-FL，1-307aa）的全长具有转录活性。相反，没有硫解酶活性位点的截短CmNAC25（CmNAC25-S，1-275aa）没有转录激活活性（图4C）。为了剖析其他植物物种中CmNAC25与NAC转录因子的系统发育关系，研究者构建了毗邻系统发育树。如图4D所示，NAC家族分为几组，与之前的研究相似。此外，CmNAC25与AtNAC25的亲缘关系最为密切，属于II组（图4D）。这些结果表明，属于NAC家族的CmNAC25可能是一种转录激活因子。
图4. CmNAC25 的亚细胞定位、多序列比对、转录活性和系统发育剖析。A CmNAC25在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片表皮细胞中的亚细胞定位剖析。比例尺= 50 μm。B 拟南芥CmNAC25及其同系物的序列比对（AtNAC018，AT1G52880；ATNAC025，AT1G61110；ATNAC029，AT1G60490；ATNAC047，AT3G04070；AtNAC056， AT3G15510）、甘蓝（Brassica oleracea）（BoNAC019，Bol039157）和苹果（Malus domestica Borkh）（MdNAC42，MDP0000173636）。绿色框表示守旧的 NAM 构造域。C 酵母系统中 CmNAC25 的转录活性剖析。用pCL1构建体转化的酵母细胞作为阳性对照，用空载体pGBKT7转化的酵母细胞作为阴性对照。SD/-H/A 表示 His 和 Ade 的合成营养毛病型培养基。D 不同物种NAC蛋白的系统发育剖析。比例尺（1）表示分支长度。
5 CmNAC25 直接结合并激活 CmMYB6 和 CmDFR 的启动子
为了进一步探究CmNAC25在花色中的浸染，研究者采取Y1H法对CmNAC25与CmMYB6启动子或关键构造基因的相互浸染进行了研究，结果表明，CmNAC25可以直接与CmMYB6的启动子或关键构造基因CmDFR结合（图5A，B），而不是其他构造基因（图 S3A）。如图5A所示，与pGADT7-CmNAC25 构建体共转化的酵母细胞和pHIS2-CmMYB6pro（−1219 bp）在含有或不含 50 mM 3-AT 的SD/-L/T/H 培养基上成长。然而，具有 CmMYB6pro-1 （−1219 ~−400 bp） 或 CmMYB6pro-2（−1219 ~−800 bp）插入的 pHIS2 载体的转化体在供应 50 mM 3-AT 的 SD/-L/T/H 培养基上无法成长。结果表明，CmNAC25与CmMYB6启动子−400 ~ 0 bp区域结合。根据先前的研究，具有CGT序列的NAC构造域蛋白的DNA结合基序是NAC结合序列的主要核心，其反向补体是ACG。研究职员在 CmMYB6 的启动子区−400 ~ 0 bp区域创造了两个ACGT元件。接下来，电泳迁移率位移试验（EMSA）表明，第一个突变ACGT元件的结合探针仍旧存在。相反，当第二个或两个ACGT元件发生突变时，结合的探针消逝，表明CmNAC25直接结合位于-89~-85 bp的第二个ACGT元件上的CmMYB6启动子（图5C）。图5B 显示，与 pGADT7-CmNAC25 构建体和 pHIS2-CmDFRpro （−1829 bp）、pHIS2-CmDFRpro-1 （−1826 ~−400 bp）或 pHIS2-CmDFRpro-2（− 1826 ~ − 800 bp） 共转化的酵母细胞无论是否含有50 mM 3-AT均能够在SD/-L/T/H 培养基上成长。而含有 pHIS2-CmDFRpro-3（−1826 ~− 1300 bp）的转化体的构建体在供应 50 mM 3-AT 的 SD/-L/T/H 培养基上无法成长。结果表明，CmNAC25在−1300 ~−800 bp 区域与 CmDFR 启动子结合，该区域也含有一个 ACGT 元件，EMSA 表明 CmNAC25 可以直接在位于−839 ~−835 bp的第二个ACGT元件处结合 CmDFR 启动子（图 S4）。由CmMYB6-CmbHLH2蛋白复合物形成的MBW复合物对激活菊花青素的积累至关主要，通过上述结果知道CmNAC25直接与CmMYB6的启动子结合；此外，Y2H和BiFC测定结果表明 CmNAC25 不与 CmMYB6 或 CmbHLH2 相互浸染（图 S3B 和 C）。同时，当用CmNAC25代替CmTTG1时，Y3H测定显示出类似的结果（图S1C），结果进一步表明CmNAC25和CmTTG1都不会影响CmMYB6和CmbHLH2之间的相互浸染。
图5. CmNAC25 激活 CmMYB6 和 CmDFR 的启动子。A，B Y1H 测定CmNAC25与CmMYB6或CmDFR启动子不同片段之间的相互浸染。利用与 pGADT7-Gus 和 pHIS2 构建体共转化的酵母细胞作为阴性对照。SD/-L/T/H 表示 Leu、Trp 和 His 合成营养毛病型培养基。C EMSA测定表明，CmNAC25直接与位于-89~−85bp的ACGT元件处的CmMYB6启动子结合。 表示非特异性结合带。D，E 双荧光素酶实验表明，CmNAC25 激活了CmMYB6和CmDFR的启动子活性，以 CmMYB6 或 CmDFR 启动子驱动的 LUC 作为报告基因。pORE-R4-35S::NAC25载体是效应子，空载体（pORE-R4）作为对照。对照组的LUC/REN比率设置为1。偏差线表示三个生物学重复的 SD。用星号表示的样本表示显著差异（p＜0.05，t 考验）。
研究者对菊花原生质体进行双荧光素酶测定，以进一步研究CmNAC25如何调控CmMYB6或 CmDFR的表达。与对照组比较，35S::CmNAC25共表达的CmMYB6pro::Luc或CmDFRpro::Luc的LUC/REN比值显著增加（图5D，E）。这些结果表明，CmNAC25通过激活CmMYB6和CmDFR的表达来正向调节花青素的生物合成。
6 CmNAC25的表达模式与不同菊花品种朽迈花瓣中花青素的积累有关
为了探究CmNAC25是否通过促进CmMYB6和CmDFR在不同菊花品种中的表达来调控花青素的积累，研究者以“Nannong Lvdong”和“Ibis Sunny”为研究工具。与“Arctic Queen”类似，这两个品种的花瓣在着花后阶段也逐渐变红（图6A），花青素增加（图6B）。qRT-PCR剖析显示，CmNAC25在“Nannong Lvdong”、“Ibis Sunny”和“Arctic Queen”花瓣中S1-S3的表达水平上调（图6C），与表型同等。此外，CmMYB6和CmDFR的表达模式在着花后也呈上调趋势（图6D，E）。这些结果进一步表明，CmNAC25作为花青素生物合成的正调节因子，在不同菊花品种中具有相似的分子调控机制，菊花在着花后逐渐变红。
图6. 不同品种花后花瓣中CmNAC25、CmMYB6和CmDFR的含量及表达模式。A “Nannong Lvdong”和“Ibis Sunny”花瓣在着花后阶段的表型。比例尺= 1cm。 B “Nannong Lvdong”和“Ibis Sunny”花瓣中三个花期的总花青素含量（TA）。C-E “Nannong Lvdong”、“Ibis Sunny”和“Arctic Queen”花瓣中CmNAC25、CmMYB6和CmDFR的表达水平。偏差线表示三个生物学重复的 SD。小写字母表示显著差异（p＜0.05，方差剖析，Tukey校正）。
7 CmNAC25的过表达促进烟草花瓣中花青素的积累
为了证明CmNAC25在调节花青素生物合成中的浸染，研究者利用农杆菌介导的方法将pORE-R4-CmNAC25载体转化烟草（Nicotiana tabacum）。T1代为4个过表达CmNAC25的转基因品系，个中3个（21#、40#和45#）的花色比WT更红，而个中一个的花色与WT相似（图7和图S5）。与WT比较，3个转基因品系花色更红（图7A），花瓣中花青素含量增加，转基因品系21#、40#和45#的花青素含量分别比WT高约72%、80%和54%（图7B）。qRT-PCR剖析表明，CmNAC25转录本仅在转基因系中表达（图7C）。此外，内源基因中NtDFR的表达水平在转基因株系中勾引最为显著（图7D）。这些结果表明，CmNAC25是植物花青素生物合成的正调节因子。
图7. CmNAC25的过表达勾引烟草中的花色和花青素积累。A CmNAC25过表达品系和WT植株的表型。B WT和转基因植物花瓣中的总花青素（TA）。C 转基因系和WT的转录本CmNAC25。 N.D.代表未检测。D WT和转基因植株花瓣中NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtDFR和NtANS的表达水平。偏差线表示三个生物学重复的 SD。用星号表示的样本表示显著差异（p＜0.05，t 考验）。
8 CmNAC25调控菊花花瓣中花青素的生物合成
为了进一步表征CmNAC25在菊花中的功能，研究者选择具有可用遗传转化系统的菊花品种“Jinba”得到过表达的CmNAC25和RNAi-CmNAC25转基因株系（图8A）。如图8A所示，与WT比较，两个OE-CmNAC25系4#和9#的花瓣呈现出更红的颜色。比较之下，在RNAi-CmNAC25的两个品系（23#和25#）中，在初始朽迈阶段（完备着花后10天）不雅观察到较浅的花瓣阴影。此外，在过表达的CmNAC25植株的花瓣中检测到的花青素含量显著增加。比较之下，RNAi-CmNAC25转基因株系的花瓣中花青素含量低于WT的花瓣，这与表型同等（图8B）。
图8. CmNAC25的过表达和抑制影响了转基因菊花“Jinba”的花瓣着色和花青素的生物合成。A WT和转基因品系OE-CmNAC25 4#、9#和RNAi-CmNAC25 23#、25#在朽迈初期的花表型。B WT和转基因植物花瓣中总花青素含量（TA）。C CmNAC25、CmMYB6和CmDFR在OE-CmNAC25转基因株系和WT中的表达。 D CmNAC25、CmMYB6和CmDFR在RNAi-CmNAC25转基因株系和WT中的表达。 偏差线表示3个生物学重复的SD。用星号表示的样品表示WT和转基因品系之间的显著差异（p＜0.05，t考验）。
qRT-PCR剖析表明，与WT比较，CmMYB6和CmDFR的表达水平与CmNAC25表达同等，在两个过表达的CmNAC25品系中显著升高（图8C）。比较之下，这三个基因的表达水平在两个RNAi-CmNAC25系中显著下调（图8D）。以上结果进一步表明，CmNAC25在花后阶段通过促进菊花花瓣中CmMYB6和CmDFR的表达来正向调控花青素的生物合成。此外，CmNAC25介导的转基因“Jinba”中花青素的积累只发生在着花后阶段。完备着花阶段过表达的CmNAC25品系仍为白色；这应归因于CmMYB#7的高表达在着花期毁坏了CmMYB6-CmbHLH2蛋白复合物，毁坏了花青素的生物合成。
此外，为了得到更多关于CmNAC25潜不才游调控网络的信息，研究者利用WT和RNAi-CmNAC25转基因株系23#（RNAi23#）在初始朽迈阶段的花瓣进行RNA-Seq剖析（图S6）。在WT和RNAi23#花瓣之间的转录组成比拟较中检测到8120个DEGs。与WT比较，RNAi23#中上调了5149个DEGs，下调了2971个DEGs（图S6A）。在花青素生物合成路子中，包括CmDFR在内的大多数构造基因在RNAi23#中下调，RNAi23#花瓣中的花青素少于WT（图S6B）。RNAi23#花瓣中MYB6、MYB114、MYB111、bHLH63等多个转录因子编码基因下调，EGL3（bHLH）上调。然而，WT和RNAi23#之间MYB#7的表达水平没有显著差异（图S6C）。这些结果表明，在转基因株系中，CmNAC25通过调控CmMYB6、CmDFR和其他基因来调控花青素的生物合成，而不是MYB#7。
谈论
菊花作为一种主要的切花材料，其颜色具有很高的经济代价。研究表明，菊花的粉赤色、赤色和紫色花瓣由不同含量的花青素供应。在一些菊花品种中，花瓣颜色在着花过程中发生变革，包括花瓣颜色的加深和花瓣颜色的褪色，这是由于花青素含量的变革而引起的，极大地影响了菊花的经济代价。理解上述变革过程的分子机理对菊花的分子育种非常主要。
在花瓣朽迈的过程中，会发生一系列生理指标的变革，以及花瓣颜色的变革。对付一些不雅观赏植物，花药开裂，花瓣颜色褪色；例如，芍药“Coral Sunset”和“Pink Hawaiian Coral”的花色在着花后阶段由粉赤色变为淡黄色，在湖北海棠Rehder的发育过程中，花朵由赤色变为白色。在当代月季中，花朽迈伴随颜色褪色，不雅观赏代价损失。当菊花花瓣在着花后进入朽迈阶段时，发生的颜色变革分为两类。一是花青素含量降落，花瓣颜色褪色；花青素的生物合成是一个耗能的过程，由于涉及的氧化还原过程须要高能量，在花后减少其生物合成可能是为了节省能源和延长着花期；另一种是花青素开始积累，花色逐渐变红，如本研究选择的植物质料，即“Arctic Queen”“Nannong Lvdong”，“Ibis Sunny”。研究职员创造花青素的逐渐积累导致了上述表型。花药裂开决定了觅食者可以网络的可用花粉，因此蜜蜂等昆虫的授粉发生在花药裂开之后。这意味着花青素在着花后阶段开始积累，花瓣逐渐变红可能对吸引昆虫传粉者具有主要意义。此外，植物朽迈时会产生大量的活性氧（ROS），已知花青素可以打消自由基，因此花后阶段花青素的积累也可能参与花瓣中ROS的打消。
花青素是类黄酮生物合成路子的产物，在该路子中一系列构造基因的持续催化下产生。先前的研究表明，该通路受到经典MBW复合物的正调控，其特色是菊花中的MYB6-bHLH2。MYB TFs（转录因子）是类黄酮生物合成路子中构造基因的关键调节剂。不同阶段对“Arctic Queen”样品的转录组剖析表明，与花青素生物合成和MBW复合物成员干系的构造基因的表达水平与花青素积累的增加同等（图1和图3）。这表明，上游潜在转录因子可能通过MBW复合物和一系列构造基因发挥浸染。先前的研究表明，TFs通过MBW复合物调节花青素的生物合成；例如，HAT1与MYB75相互浸染并滋扰MBW蛋白复合物，以抑制拟南芥中pap1-D植物丰富的花青素表型。此外，PpMYB18是花青素和PA积累的负调节因子，可以与MYB激活剂竞争与bHLHs结合，从而滋扰MBW蛋白复合物。然而，到目前为止，通过MBW复合物起浸染的TF在菊花中险些没有特色。
研究职员表征了 CmMYB6 上游的转录因子 CmNAC25，它可以通过促进 CmMYB6 和 CmDFR 的表达来作为花青素生物合成的正调节因子。此外，还对转基因“Jinba”和WT进行了转录组剖析。在RNAi-CmNAC25转基因株系中，CmNAC25的表达显著低于WT，不仅CmMYB6和CmDFR的表达水平显著降落，而且其他花青素生物合成基因的表达水平也显著降落（图S6），由于CmMYB6-CmbHLH2是花青素生物合成路子的上游正调节因子。同时，研究职员创造RNAi-CmNAC25转基因株系中存在一些与WT比较差异表达的候选TFs，如几种MYB TFs和bHLH TFs（图S6）。这表明，只管CmNAC25不与其他构造基因的启动子结合，但它可能通过调节这些潜在的转录因子来影响这些基因的表达。
NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）蛋白是最突出的植物特异性TF家族之一，具有守旧的N端NAM构造域。NAC TF已被证明可以调节多种生物学过程，包括枝条顶端分生组织的形成和坚持、花的发育、对应激勾引着花勾引的掌握、胚胎发育、激素旗子暗记传导和次级细胞壁合成的调节。CmNAC25 属于 NAC 基因家族，其 N 末端具有守旧的 NAM 构造域（图 4B）。先前的研究表明，转录激活结构域存在于C末端区域，而不是NAM构造域。研究职员的结果也解释了相同的事实，即截断 C 末端 （CmNAC25-S） 后的 CmNAC25 序列没有转录激活活性（图 4C）。系统发育剖析表明，NAC TF家族规模弘大，包含多少亚群，如图4D所示，个中CmNAC25属于II组，与AtNAC25亲缘关系最为密切。其余还有两个基因BoNAC19和MdNAC42，它们被表征为花青素生物合成的调节因子，并且也属于II组，它们与CmNAC25密切干系。在苹果中，MdNAC42是掌握红肉苹果花青素色素沉着的调控网络的主要正调节因子。然而，BoNAC019的过表达通过降落拟南芥中花青素基因的表达水平来减少花青素的积累。这表明，纵然在同一组系统发育树中，NAC基因作为花青素生物合成调节因子的功能也发生了不合。在本研究中，CmNAC25 被表征为花青素生物合成的正调节因子。
在以往的研究中，Xiang等人创造“Jinba”在着花期涌现白色的缘故原由是R3 MYB转录因子CmMYB#7与CmbHLH2相互浸染，毁坏了菊花花青素生物合成所必需的MBW蛋白复合物CmMYB6-CmbHLH2，从而阻断了白色花瓣中花青素的生物合成。在着花后阶段，CmMYB#7的表达降落，CmbHLH2被开释形成CmMYB6-CmbHLH2复合物，花瓣开始积累花青素，揭示了CmMYB#7在菊花蛋白水平上负调控MBW复合物形成的分子机制。在本研究中，研究者还创造，在“Arctic Queen”中，花青素积累的开始也可能是由 CmMYB#7 表达降落（图 S2）和 MBW 蛋白复合物中 CmbHLH2 成员的开释引起的（图 9）。此外，本研究首次表征了 CmMYB6 上游的正调节因子 CmNAC25，并揭示了菊花着花后花瓣中花青素逐渐积累过程中转录水平的调控。在 RNAi-CmNAC25 转基因系中，与 WT 比较，CmMYB#7 没有差异表达（图 S6），这表明 CmNAC25 可能不是 CmMYB#7 的上游。因此，本研究阐明了激活因子 CmNAC25 和隔断蛋白 CmMYB#7 在花青素积累的折衷调控中发挥不同的浸染，勾引菊花在着花后阶段变红（图 9）。
图9. CmNAC25调控的花青素在花后阶段的生物合成模型。虚线框表示CmNAC25、CmMYB6、CmbHLH2和CmDFR在盛花期的表达水平相对较低，而CmMYB#7在花后阶段的表达水平相对较低。实心框表示CmMYB#7在盛花期高表达，CmNAC25、CmMYB6、CmbHLH2和CmDFR在着花后表达水平上调。
综上所述，本研究探究了菊花后花瓣着色的分子机制。着花后阶段花青素的逐渐积累表现为花瓣逐渐变红。在着花后花瓣中上调的转录因子 CmNAC25 被证明位于 MBW 复合物成员 CmMYB6 和关键花青素生物合成基因 CmDFR 的上游。此外，它通过直接或间接调控多个基因作为花青素生物合成的正调节因子，这被转基因植物（包括烟草和菊花）的表型所认可。综上所述，CmNAC25在花青素勾引的菊花花瓣着色中起着至关主要的浸染。
